《The Plant Journal》：Genetic architecture of low-temperature germinability in rice revealed by integrated maps of SNPs and structural variation
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低温萌发性（Low-temperature germinability, LTG）限制了水稻直播栽培的应用，但其遗传架构及结构变异（structural variations, SVs）的调控作用仍不清楚。研究人员评估了403份水稻种质在四个温度条件（13°C
低温萌发性（Low-temperature germinability, LTG）限制了水稻直播栽培的应用，但其遗传架构及结构变异（structural variations, SVs）的调控作用仍不清楚。研究人员评估了403份水稻种质在四个温度条件（13°C、15°C、18°C、21°C）下的LTG表型。通过整合SNP/SV全基因组关联分析（GWAS）、转录组测序（RNA-seq）、基因编辑、群体遗传学及机器学习方法，研究人员解析了LTG的遗传基础，并构建了基因组选择（genomic selection, GS）预测模型。该种质群体展现出广泛的LTG变异，且与原产地纬度呈负相关。基于SV和SNP的GWAS分别检测到119个和127个数量性状位点（QTL），其中25个位点在两种数据集间重叠。结合GWAS与RNA-seq，研究人员筛选出30个候选基因和48个有利单倍型，其中高LTG有利等位基因富集于低纬度籼稻（Xian/Indica）种质中。研究人员鉴定到qLTG3-1编码区的一个缺失变异对LTG起负调控作用，并通过基因编辑（CRISPR/Cas9）证实qLT11d是调控LTG的关键基因。群体遗传学分析鉴定了29个亚种间（Xian–Geng）和37个Xian亚种内与LTG相关的分化区域，暗示低温和制下亚种间及亚种内存在共同的选择区域。利用SNP和SV数据，研究人员基于机器学习的MFGP方法构建了相应的GS模型，在所有温度条件下均实现了较高的预测精度。所有跨温度预测的相关性均超过0.55，且在18°C时表现最佳。本研究结果阐明了水稻LTG的遗传架构，并揭示了SVs可能存在的调控作用，值得进一步探究，同时为直播稻LTG遗传改良提供了候选基因、有利单倍型及GS模型。
一、研究背景与科学问题
水稻是全球最重要的粮食作物之一。与传统移栽方式相比，直播栽培因其简便性和低成本而在世界范围内日益普及。然而，水稻种子萌发的适宜温度范围为25°C至35°C，但在中国南方大部分地区或高纬度地区，早稻播种期间的土壤温度常低于18°C，甚至低于15°C。低温导致的种子萌发不良和幼苗建植困难，已成为限制水稻直播应用的主要因素之一。因此，培育具有高低温萌发性（Low-temperature germinability, LTG）的水稻品种至关重要。尽管此前已克隆了至少九个LTG相关基因，如qLTG3-1、OsSAP16、OsCAT2、OsABI5等，但这些已知基因仅能解释LTG变异的一小部分，尚不足以支撑分子标记辅助育种。此外，关于籼稻（Xian/Indica）和粳稻（Geng/Japonica）两个主要亚种间LTG差异的研究结果存在矛盾。作为一种重要的基因组变异类型，结构变异（Structural variations, SVs）因其较大的片段长度，预期会对表型产生较大影响，但目前将SVs大规模用于基因/QTL发掘的研究仍然较少。为此，研究人员开展本研究，旨在通过整合单核苷酸多态性（Single-nucleotide polymorphisms, SNPs）和SVs的全基因组关联分析（Genome-wide association study, GWAS），并结合转录组学、群体遗传学和机器学习等方法，系统解析水稻LTG的遗传架构，为分子育种提供理论依据和资源。
二、主要研究方法
研究人员使用了来自26个国家的403份水稻种质进行LTG表型评估，并在四个温度梯度（13°C、15°C、18°C、21°C）下测定了39个种子萌发和幼苗相关参数。采用二代测序技术获取全基因组SNP数据，并使用Delly软件检测五种类型的SVs（缺失、插入、重复、倒位和断点）。基于混合线性模型（Mixed Linear Model, MLM）分别在全体群体、Xian亚群（n=259）和Geng亚群（n=121）中进行SNP和SV的GWAS分析。选取八个极端表型种质进行RNA-seq转录组分析。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在Nipponbare（NIP）背景下对候选基因qLT11d进行功能验证。最后，基于机器学习的MFMGP融合模型构建了基因组选择（Genomic selection, GS）预测模型。
三、研究结果
3.1 403份水稻种质的群体结构
基于SNP构建的系统发育树将403份种质分为五个主要亚群：259份Xian、121份Geng、9份混合型（Adm）、4份Aus和8份Basmati（Bas）。主成分分析（Principal component analysis, PCA）显示第一主成分解释了SNP总遗传变异的36.4%，有效区分了Xian和Geng两个主要亚种。基于SV的分类结果与SNP高度一致（99.3%）。共鉴定出67,134个高质量SVs，其中14,797个为Xian特异性SVs，5,574个为Geng特异性SVs，这些亚种特异性SVs占全部SVs的30.3%，对亚种分化有重要贡献。
3.2 LTG表型变异
403份种质在四个温度处理下表现出显著的LTG变异。随着测试温度降低，种子萌发所需时间显著增加，萌发指数（Germination index, GI）和幼苗指数（Seedling index, SI）相应下降。方差分析表明，Xian与Geng亚种间、亚种内不同种质间以及四个温度间均存在显著差异，且亚种与温度之间存在显著互作效应。平均而言，Geng种质在四个低温处理下的萌发和早期幼苗生长均显著慢于Xian种质。
3.3 基于SNP的GWAS鉴定LTG的QTL
在全体、Xian和Geng三个群体中共初步检测到506个显著关联的SNPs，合并后得到127个QTL，其中包括全体群体90个、Xian群体63个、Geng群体19个。在四个温度下分别检测到58、64、71和62个QTL，其中13个QTL在所有四个温度下均被检测到。
3.4 基于SV的GWAS鉴定LTG的QTL
基于SV的GWAS初步检测到566个显著关联的SVs，合并后得到119个QTL，包括全体群体60个、Xian群体61个、Geng群体30个。在四个温度下分别检测到44、44、79和45个QTL。比较SNP和SV的结果发现，102个QTL（46.2%）仅由SNP鉴定，94个（42.5%）仅由SV鉴定，25个（11.3%）在两个数据集中重叠，表明SV-GWAS是对传统SNP-GWAS的重要补充。
3.5 重要QTL的鉴定
基于多个温度、多个参数和/或多个群体的检测标准，SNP-GWAS鉴定出13个重要QTL，SV-GWAS鉴定出9个重要QTL。其中部分QTL与先前研究报道的位点共定位。
3.6 qLTG3-1的单倍型分析与适应性
位于3号染色体约0.22 Mb处的重要QTL（qLT3a/ qLTv3a）的领先SV位于qLTG3-1（Os03g0103300）的编码区。携带该缺失变异的种质萌发能力显著降低，表明该SV对LTG具有负调控作用。该缺失在Geng群体中频率较高（31/121），而在Xian群体中极低（1/259）。单倍型分析结合启动子区的四个显著SNPs和编码区的SV，鉴定出四个主要单倍型，其中Hap1和Hap2为有利单倍型，富集于低纬度Xian种质中；而低LTG的Hap4则富集于高纬度Geng种质中，支持了qLTG3-1在纬度适应中的作用。
3.7 高低LTG种质的比较转录组分析
对四个高LTG和四个低LTG种质的RNA-seq分析显示，低温处理后，高LTG群体诱导的差异表达基因（Differentially expressed genes, DEGs）数量多于低LTG群体。在低温处理4小时和8小时后，高低LTG群体间共有大量DEGs，同时也存在各自特异的DEGs。
3.8 候选基因的优异等位变异
通过整合GWAS定位、RNA-seq差异表达和单倍型表型差异分析，从11个重要SNP-QTL中筛选出25个候选基因和43个有利单倍型。对于5个SV-GWAS独立检测到的重要位点，也进行了单倍型分析，鉴定出各自的有利单倍型。总体而言，有利单倍型主要富集于低纬度Xian种质中。
3.9 qLT11d的功能验证与自然变异分析
qLT11d是影响多个LTG性状的最大效应位点。通过CRISPR/Cas9基因编辑获得的两个敲除突变体（KO1和KO2），在低温条件下的种子萌发率和幼苗出土率均显著低于野生型Nipponbare（NIP），证明qLT11d是LTG的正调控因子。单倍型分析表明，其Hap1在高纬度Geng种质中高度富集（96.0%），并与最低的LTG表型相关。
3.10 候选基因的存在-缺失变异（PAVs）分析
对25个候选基因在539份水稻种质中的PAV分析发现，7个基因为分布基因。其中，Os02g0727100、Os010g0527800和Os10g0528400的存在与否与LTG表型显著相关，表明基因PAVs是水稻群体LTG表型变异的重要贡献因素。
3.11 LTG的遗传架构
403份种质的原产地纬度与LTG参数呈显著负相关，且这种相关性在Xian和Geng亚种内部依然稳健。低纬度地区的种质携带更多高LTG有利等位基因，而高纬度Geng种质则携带较多低LTG等位基因。在七个极高LTG和七个极低LTG种质的比较中，高LTG种质在大多数候选基因上拥有高LTG等位基因，表明聚合更多高LTG等位基因是培育高LTG品种的有效策略。
3.12 LTG的亚种间与亚种内遗传分化
通过群体分化统计量（FST）分析，在Xian-高LTG与Geng-低LTG群体间鉴定出61个高度分化的基因组区域，其中29个与已鉴定QTL重叠。在Xian亚种内的高LTG与低LTG群体间鉴定出80个高度分化区域，其中37个与28个QTL重叠。两种分化分析共同发现了12个重叠区域，表明部分基因组区域在亚种间和亚种内均受到选择。对这些区域中DEGs的GO和KEGG富集分析显示，它们主要涉及温度刺激响应、冷驯化、类黄酮生物合成等通路。
3.13 基于机器学习的LTG基因组选择系统
基于SNP和SV数据集，使用MFMGP融合机器学习模型构建了预测GT50（达到50%萌发所需时间）的GS模型。SNP和SV数据集在四个温度下的预测精度（皮尔逊相关系数，PCC）均高于0.6。SV数据集在13°C和21°C时的预测精度显著高于SNP数据集。跨温度预测分析显示，所有跨温度预测的相关性均超过0.55，其中以18°C为训练条件的模型表现出最佳的跨温度预测性能。外部验证表明模型具有一定的跨群体预测能力，但亚种间的预测精度较低。
四、讨论与结论
本研究表明，SVs是发现复杂性状QTL/基因的极其有用的标记。SV-GWAS能够鉴定出不同于SNP-GWAS的QTL，两者整合是阐明复杂性状遗传基础的有效策略。研究发现SVs具有一些有趣的特征，如纯合基因型频率通常低于NSV基因型、Geng群体的平均SV频率远高于Xian群体等。研究还发现，Xian种质在四个温度下的平均萌发率和幼苗率均高于Geng种质，这与通常认为Geng耐寒性更强的认知有所不同，表明LTG主要反映的是萌发活力而非对持续低温的耐受性，且低纬度地区早稻播种时常遭遇短暂寒潮，促进了快速萌发特性。研究结论指出，Xian与Geng在LTG上的分化很大程度上是由控制LTG的不同QTL/基因以及许多基因位点上高、低LTG等位基因的差异共同决定的。本研究鉴定出的43个高LTG有利等位基因和25个候选基因，经确认后可为进一步通过基因/等位基因聚合改良水稻LTG提供有用信息。同时，基因编辑实验证实了Os11g0438000作为LTG正调控因子的功能，与自然变异的关联分析相互印证。
