《The Plant Journal》：Natural variation in a FtMYB32-FtCES18 module drives Rhizoctonia solani resistance by reprogramming jasmonate and flavonoid metabolism in Tartary buckwheat
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苦荞（Fagopyrum tataricum）以其对复杂生长条件的适应性和胁迫耐受性而闻名。然而，土传坏死性病原菌如立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）经常造成毁灭性病害，严重损害其产量和品质。本研究通过全基因组关联分析（GWAS），鉴定到一个羧
苦荞（Fagopyrum tataricum）以其对复杂生长条件的适应性和胁迫耐受性而闻名。然而，土传坏死性病原菌如立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）经常造成毁灭性病害，严重损害其产量和品质。本研究通过全基因组关联分析（GWAS），鉴定到一个羧酸酯酶基因FtCES18，并证明其是苦荞抗病性的核心正调控因子。过表达FtCES18显著增强植物抗性，而病毒诱导基因沉默（VIGS）则导致高度感病表型。进一步分析揭示，FtCES18高效催化茉莉酸甲酯（MeJA）水解为游离茉莉酸（JA），启动下游JA-Ile信号，并在病原侵染时快速促进内源茉莉酸类物质积累。该JA信号级联重编程宿主类黄酮代谢，促进下游防御性类黄酮（如芦丁和槲皮素）的大量积累。此外，研究人员发现转录因子FtMYB32直接结合FtCES18启动子中的MBS顺式元件以激活其表达。值得注意的是，进化分析揭示栽培苦荞FtMYB32存在与驯化相关的C端截短，该截短损害其转录激活能力，从而解释了栽培种质相较于野生祖先基础抗性降低的现象。至关重要的是，FtMYB32启动子中的一个天然单核苷酸多态性（SNP）定义了一个赋予增强基础转录活性的优良单倍型（hapC）。启动子区域的这种天然变异通过“剂量微调”效应控制FtMYB32-FtCES18模块的表达丰度，该效应随后被下游代谢级联放大，最终促成不同苦荞种质间抗病性的自然变异。本研究为培育新型高抗病苦荞品种提供了宝贵的遗传资源和理论基础。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
苦荞（Fagopyrum tataricum）作为一种重要的伪谷物作物，以其卓越的营养价值和健康功效而著称，这些益处主要归因于其富含芦丁等类黄酮次生代谢物，对预防人类心血管疾病具有显著效果。然而，苦荞的农业生产和籽粒品质受到多种真菌病害的严重威胁。其中，由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起的根腐病和猝倒病是极具破坏性的土传病害。立枯丝核菌不仅能在苦荞田间造成严重减产甚至绝收，还在全球范围内对水稻、玉米、小麦等多种主要经济作物造成毁灭性危害。目前，该病害的田间管理严重依赖化学杀菌剂，而栽培措施和生物防治效果有限。因此，鉴定内源抗病基因并培育抗病品种是控制该病害最经济、有效且环境友好的策略。
在植物抵御病原菌侵袭的免疫系统中，茉莉酸（JA）信号通路是对抗立枯丝核菌这类坏死性真菌的核心信号枢纽。在JA代谢稳态中，茉莉酸甲酯（MeJA）主要作为高度挥发且相对生物惰性的储存库。感知病原入侵后，植物必须迅速将积累的MeJA去甲基化（水解）为游离JA，随后结合形成最终活性信号分子JA-Ile，以激活下游防御信号级联。这一水解转化是决定JA信号输出幅度的关键限速步骤，由具有α/β-水解酶折叠结构域的羧酸酯酶（CES）或甲酯酶（MES）特异性催化。然而，苦荞中CES家族蛋白的具体生物学功能和底物催化特性，特别是在响应土传真菌胁迫方面的作用，此前在很大程度上尚未被表征。
此外，防御性次生代谢物的积累构成了植物免疫系统的另一道关键防线。苦荞富含类黄酮，以芦丁和槲皮素为代表。类黄酮作为植物抗毒素和抗氧化剂，在植物抵御真菌病原感染中发挥重要作用。这些防御性类黄酮的生物合成受植物体内严格的转录重编程调控。在众多调控因子中，MYB转录因子家族作为整合环境刺激和协调次生代谢网络的“主开关”，能够特异性识别并结合下游靶基因启动子中的顺式作用元件（如MBS元件），从而精确调控植物类黄酮代谢和广谱抗病性。然而，哪些核心MYB转录因子参与苦荞这一复杂防御网络并协调下游羧酸酯酶的表达，此前仍不清楚。
二、研究内容与主要结论
本研究通过整合基于320份苦荞种质资源病害指数的GWAS与时序转录组学，鉴定到核心羧酸酯酶基因FtCES18作为抗立枯丝核菌的关键调控因子。体外和体内功能表征证明，FtCES18协调激活JA信号并增强类黄酮生物合成，同时增强宿主抗氧化防御机制以清除过量活性氧（ROS），共同显著提高植物抗病性。探索其上游调控网络时，研究人员鉴定到核心转录因子FtMYB32，并确认其直接结合FtCES18启动子中的MBS元件以正向激活其表达。此外，野生与栽培种质的比较分析揭示栽培FtMYB32存在与驯化相关的C端截短，显著削弱其转录激活效能。更重要的是，研究人员发现FtMYB32启动子中的天然变异（T/C单核苷酸多态性）是驱动苦荞自然群体抗病性分化的关键遗传基础。携带优良单倍型hapC的种质表现出更强的基础和激活态FtMYB32转录活性，从而更有效地促进下游“FtCES18-JA-类黄酮”防御级联。该研究不仅阐明了苦荞抵御坏死性土传病原菌的分子和遗传机制，还为培育高抗病品种提供了清晰的理论见解和潜在的遗传标记靶点。
三、关键技术与方法
研究人员利用320份苦荞核心种质资源（由中国农业科学院作物科学研究所荞麦种质资源课题组提供）的病害指数表型数据，结合已发表的全基因组重测序数据开展GWAS分析，并通过连锁不平衡（LD）分析界定候选区间。采用时序转录组学筛选病原响应基因，利用病毒诱导基因沉默（VIGS）和过表达转基因体系进行正反向遗传学验证，运用LC-MS/MS靶向代谢组学定量茉莉酸类物质，通过分子对接模拟酶-底物结合，采用凝胶迁移实验（EMSA）、酵母单杂交（Y1H）、双荧光素酶报告系统和染色质免疫沉淀-qPCR（ChIP-qPCR）验证蛋白-DNA互作，利用HPLC靶向代谢组学分析类黄酮代谢流，并结合单倍型分析和群体遗传学解析自然变异。
四、研究结果
GWAS与转录组学鉴定与立枯丝核菌抗性相关的羧酸酯酶基因。 对320份苦荞核心种质进行抗病表型鉴定，表型值呈连续变异，表明该群体抗病性是由多基因控制的复杂数量性状。GWAS在8号染色体上检测到显著关联信号（-log10P>5.0），LD分析显示该候选区域内存在明显的强连锁块。该LD区域共包含30个注释基因。时序转录组分析显示，随着侵染进程推进，其中4个基因（FtPinG0809058500.01、FtPinG0809059200.01、FtPinG0809059600.01和FtPinG0809060200.01）表达显著上调。在JA处理转录组数据中，仅FtPinG0809058500.01的表达随处理时间延长逐渐增加，提示该基因可能通过JA信号通路介导苦荞抗病性。该基因编码羧酸酯酶CES18。组织特异性表达分析显示FtCES18在茎中表达最高，其次为根；GUS染色显示强信号定位于根系网络和下胚轴/茎基部区域，与立枯丝核菌主要侵染根和茎基部的特性高度吻合。
FtCES18通过重塑ROS稳态增强立枯丝核菌抗性。 研究人员生成了3个独立的FtCES18过表达拟南芥株系（OE1、OE2、OE3），离体叶片接种实验显示OE株系病斑面积显著小于野生型（WT）。DAB组织化学染色显示感染WT叶片积累大量H2O2，而OE叶片中信号显著减弱。生理生化测定表明，侵染后OE株系MDA含量显著低于WT，POD和SOD活性显著高于WT，H2O2和O2•?积累显著受抑。在本氏烟叶片瞬时过表达FtCES18同样显著减小病斑。在苦荞原生体系中进行VIGS沉默FtCES18后，叶片表现出高度感病表型，出现快速萎蔫和显著坏死病斑。
FtCES18通过介导MeJA水解增强苦荞抗病性。 亚细胞定位显示FtCES18-GFP融合蛋白特异性定位于内质网（ER）。系统发育分析显示FtCES18与双子叶植物CES18同源蛋白聚为一支，与Rumex salicifolius的CES18亲缘关系最近。分子对接模拟显示MeJA能良好适配FtCES18蛋白表面的活性结合口袋，结合能为?5.72 kcal/mol，MeJA与FtCES18的VAL-183残基形成2.2 ?的紧密分子间相互作用。体外酶活实验通过LC-MS/MS确认重组GST-FtCES18蛋白能以MeJA为底物催化生成游离JA。体内代谢物定量显示，过表达FtCES18显著加速MeJA消耗并触发JA和JA-Ile的积累；VIGS沉默则导致JA含量显著下降。RT-qPCR分析显示，病原侵染触发JA通路基因（AtLOX2、AtJAZ1、AtJAR1）和防御标记基因（AtPDF1.2）高度同步的转录级联。
FtCES18介导的JA信号重编程苦荞类黄酮代谢。 外源MeJA处理显著诱导苦荞叶片总类黄酮积累。JA处理时序转录组热图显示，类黄酮生物合成通路几乎所有关键结构基因（PAL、C4H、4CL、CHS、CHI、F3H、FLS、F3GT、F3RT、RT等）均被协调激活。靶向HPLC定量显示，在FtCES18过表达毛状根中，上游底物苯丙氨酸显著减少，中游产物柚皮素、二氢山奈酚和二氢槲皮素显著增加；侧支产物（原花青素、儿茶素、花青素）和山奈酚积累显著受抑，而代谢流主要导向“槲皮素及其糖基化衍生物”主通路，导致防御性类黄酮（槲皮素、槲皮苷、异槲皮苷和芦丁）显著积累。
转录因子FtMYB32直接结合并正向调控FtCES18。 时序共表达聚类分析将FtCES18归入Cluster 8模块，KEGG富集显示该模块基因显著富集于“内质网蛋白质加工”和“内吞作用”等免疫相关通路。FtCES18启动子2000-bp区域内预测到多个串联MBS元件。通过筛选Cluster 8中与FtCES18高度共表达（Pearson's r>0.8）的MYB转录因子，鉴定并克隆了FtMYB32。EMSA证实重组FtMYB32蛋白能特异性结合含MBS元件的探针；Y1H和双荧光素酶报告系统验证了FtMYB32对FtCES18启动子的直接结合和转录激活；ChIP-qPCR证实FtMYB32在体内富集于FtCES18启动子MBS区域。FtMYB32严格定位于细胞核。在FtMYB32过表达苦荞毛状根中，FtCES18表达上调7-12倍；VIGS沉默FtMYB32后两者表达协调显著下调。FtMYB32过表达还显著上调核心芦丁合成通路基因（FtF3H、FtF3′H、FtFLS、FtRT1）。瞬时表达FtMYB32显著提高内源JA含量并减小病斑。
FtMYB32启动子天然变异驱动苦荞抗病性分化。 FtCES18编码区和启动子区域缺乏与抗病表型显著关联的SNP，表明该核心基因在进化中高度保守。FtMYB32启动子中鉴定到一个T/C转换SNP（位置45 176 088），据此将群体分为hapT（T等位基因）和hapC（C等位基因）两种主要单倍型。表型关联分析显示，携带C/C纯合等位基因（hapC）的种质病害指数显著低于T/T纯合（hapT），杂合（T/C）群体表现中间抗性。双荧光素酶和酵母报告系统一致证明hapC启动子活性显著强于hapT。将两种单倍型分别以其天然启动子驱动FtMYB32表达作为效应子，与FtCES18启动子驱动的报告基因共表达，结果显示hapC启动子驱动的FtMYB32能显著增强下游FtCES18启动子活性。在自然群体中随机选取代表性种质验证，hapC种质的FtMYB32和FtCES18表达水平、JA含量、总类黄酮含量均显著高于hapT种质，离体叶片接种实验确认hapC组具有更强抗病性。
栽培与野生苦荞中FtMYB32的天然变异。 野生与栽培种质的基因组序列比较显示FtCES18无明显变异，但FtMYB32在栽培种质中存在氨基酸缺失。该截短源于编码序列中的单核苷酸缺失，导致移码突变并引入提前终止密码子，使栽培FtMYB32蛋白在高度可变的C端缺失30个氨基酸。野生种质中FtCES18表达和JA积累均显著高于栽培品种。EMSA显示，由于N端DNA结合域完整，全长野生型和截短栽培型FtMYB32蛋白均能结合FtCES18启动子MBS元件，但野生型结合亲和力显著更强。双荧光素酶报告实验证明野生型FtMYB32对FtCES18启动子的转录激活能力显著强于截短变体。该驯化相关的结构变异揭示了栽培苦荞基础抗病性通常弱于野生祖先的原因，可能反映了人工选择高产过程中典型的“生长-防御权衡”。
五、讨论与结论
立枯丝核菌对苦荞生产构成重大威胁。本研究通过320份核心种质资源的抗病性评价结合重测序数据，鉴定到显著SNP位点和30个候选基因，其中FtCES18被确认为核心效应基因。FtCES18作为羧酸酯酶，具有专门适配MeJA的催化口袋，能够高效催化MeJA水解为游离JA，进而启动JA-Ile信号。FtCES18在根和叶片组织中的特异性高表达为抵御病原入侵提供了空间上的第一道防线。FtCES18过表达通过快速提升侵染期JA水平，增强宿主抗氧化酶系统（POD和SOD）响应，有效阻断不可逆的脂质过氧化和病理性细胞坏死。在次生代谢层面，FtCES18驱动的JA信号不仅转录水平上调防御相关基因，还在代谢水平促进类黄酮化合物合成，这些类黄酮既能直接抑制病原生长，又能有效缓解氧化胁迫，协同建立苦荞对立枯丝核菌的防御网络。
在调控网络层面，FtMYB32直接结合FtCES18启动子中的MBS顺式元件激活其表达，FtCES18作为连接激素信号和类黄酮调控网络的关键节点。群体遗传学分析显示FtCES18在进化中经历严格纯化选择而高度保守，而FtMYB32启动子中的T/C SNP直接分层了苦荞群体的抗性等级。优良单倍型hapC通过“剂量微调”效应在启动子水平提升FtMYB32的基础和激活态转录能力，级联放大至下游FtCES18表达，最终赋予hapC种质更强的JA爆发和类黄酮生物合成。代谢GWAS重分析发现槲皮素含量关联信号紧邻FtMYB32基因组位点，为FtMYB32协调下游防御性类黄酮积累提供了群体水平的遗传证据。野生与栽培苦荞的比较分析揭示，栽培种质中FtMYB32的C端截短显著削弱其转录激活活性，这可能是驯化过程中为降低过度JA爆发的代谢代价而进行的适应性选择，在维持基础免疫响应的同时平衡生长需求。
综上所述，本研究描绘了一个连接转录控制、激素激活和代谢输出的层级调控模块，FtMYB32-FtCES18模块有效桥接了病原诱导的JA爆发与下游防御性类黄酮积累。研究强调了顺式调控多态性和驯化相关结构变异协同驱动植物免疫表型多样化的机制，为培育富含生物活性化合物且具有抗病性的新型苦荞品种提供了优良遗传靶点和坚实的理论基础。
