pH与血红素协同驱动的从头设计自组装血红素结合蛋白高分辨率晶体结构解析

《Protein Science》：The X-ray crystallographic structure of a designed, self-assembling, and heme-binding protein

　　

从头设计的血红素结合蛋白为阐明序列、寡聚化状态及环境如何决定辅因子配位提供了强力的最小化支架，然而此类体系的高分辨率结构数据仍然稀缺。本文报道了一种从头设计的、自组装α-螺旋血红素结合蛋白在1.9 ?分辨率下的高分辨率晶体结构，该蛋白经历了显著的pH及辅因子驱动的重组。该结构结晶于正交晶系P212121空间群（a = 44.8 ?，b = 46.3 ?，c = 101.2 ?），每个不对称单元含一个四聚体，精修统计为Rfac/Rfree = 23.5/25.5%。脱辅基蛋白折叠为三股卷曲螺旋，而在强碱性条件下血红素结合破坏了注册特异性相互作用并驱动显著的螺旋位移。这一转变产生了具有错位ABAB排列的四股卷曲螺旋，可容纳两个双组氨酸配位的血红素。辅因子通过ε-氮原子与组氨酸配位（Fe-NHis ≈ 2.0 ?），两者相距38 ?（四吡咯环边对边距离），并近似共面排列，彼此间存在67°的旋转偏移。咪唑二面角（99°和108°）表明组氨酸轴向配体相对于血红素呈近似正交的几何构型。结晶由血红素模板化的堆积所促进，其中相邻组装体大环之间的相互作用及若干盐桥生成了扩展的超分子晶格。这些结果证明了血红素结合和质子浓度如何重塑寡聚拓扑结构并促进最小蛋白体系中的有序组装，突显了血红素结合的多重结构效应，并为稳定特定配位几何构型及利用辅因子-辅因子相互作用引导从头设计金属蛋白中的高阶组织提供了原理。

论文解读

一、研究背景与意义

天然血红素蛋白在生物体内承担着从电子传递到催化、传感等多种功能，这种功能多样性并非血红素辅因子本身固有的属性，而是源于其与精细调控的蛋白环境之间的整合。通过控制氧化还原电位、轴向配位和底物可及性，蛋白支架使选择性高效催化成为可能。从头设计（de novo design）通过降低天然蛋白固有的结构复杂性，为理解序列、堆积和寡聚化如何决定血红素结合与稳定性提供了最小化平台。

尽管近年来蛋白质结构预测技术取得了突破性进展，尤其是AlphaFold 3在诸多经典多肽上已达到较高精度，但预测结构仍可能与晶体学数据存在显著偏差，凸显了当前最先进预测模型的局限性。这些方法在捕捉蛋白质和多肽的结构可塑性方面往往力不从心，尤其当涉及金属、辅因子或非经典配位环境时更是如此。当辅因子主动驱动折叠或肽结构与环境变量（如pH）耦合时，这一挑战被进一步放大。因此，扩充实验测定结构的数据库至关重要，这不仅有助于阐明辅因子驱动的组装规则，也为训练预测性机器学习算法提供了数据支撑。

目前已有若干结构表征的从头设计血红素/卟啉结合蛋白，如Holo-MPP1通过五配位His配位稳定非生物Mn-卟啉，HEM_3.C9通过Cys配位稳定五配位血红素并具有开放的远端口袋等。然而，尚无纯粹自组装且结合血红素的卷曲螺旋的晶体结构报道，这一局限可能源于自缔合合成蛋白支架结晶的挑战。GRAND家族多肽在pH<5时形成双股卷曲螺旋（2SCC），在中性或碱性条件下溶液中形成三股卷曲螺旋（3SCC）。与血红素络合后，可重组为四股卷曲螺旋（4SCC，ABAB排列），由两个反平行二聚体组成，形成含有两个血红素的四聚体组装体。这种pH诱导的从头设计卷曲螺旋系统转换此前未见报道，展示了环境条件的微妙调节如何重定向最小螺旋支架的血红素配位化学和整体折叠。

二、主要技术方法

研究人员采用坐滴气相扩散法在293 K下进行结晶筛选，将pH 11.4的holo蛋白与pH 5.04的结晶溶液以3:1体积比混合，所得样品溶液pH为9.0。晶体数据采集方面，利用同步辐射光源Proxima-1线站收集了类似血红素负载肽的2.0 ?单波长反常散射（SAD）数据以及天然的1.9 ?衍射数据。数据处理使用XDS和SCALA，相位计算采用HySS、Phaser、Parrot和Buccaneer，模型构建与精修使用COOT和autoBUSTER，验证使用Molprobity。结构分析采用PyMol、CCP4套件及APBS静电计算。

三、研究结果

3.1 晶体结构与堆积

GRW-L16CL30H与血红素复合物的气相扩散结晶产生了细长的深红色晶体，属于正交晶系P2₁2₁2₁空间群，衍射至1.9 ?分辨率。肽序列为Ac-GWKALEEKLKALEEKCKALEEKLKALEEKHKALEEKG-NH₂，四条多肽链中三条建模了35个残基，第四条链包含33个残基，覆盖五个七肽重复长度。最终模型包含一个四聚体、51个水分子、5个氯离子和2个血红素。该结构采用左手超螺旋，由四条α-螺旋单体以约20.2°的交叉角形成四聚体，具有错位的ABAB排列以容纳两个双组氨酸配位的血红素。超螺旋形成直径约16 ?、长度65 ?的圆柱体。血红素-血红素接触以及多个盐桥和氢键相互作用共同促进晶体堆积，生成扩展的超分子晶格。

3.2 疏水核心堆积

尽管各链之间结构高度相似，螺旋注册并非完全保守：链B和D相对于链A和C滑移堆积约一个完整七肽重复。这种错位组织使两个血红素能够进行双组氨酸配位，并显著影响四聚体内的核心堆积和螺旋间相互作用。中间区域（第4-9层）每个层由两个对角相对的a-a′残基和两个d-d′残基组成，形成经典旋钮-孔洞（knobs-into-holes）堆积。末端区域（第1-2层和第11-12层）每个层仅含两个对角相对的残基，破坏了原有的堆积几何。埋藏表面积分析显示中间区域形成经典卷曲螺旋核心（a和d位置平均埋藏率分别为93%和83%），而末端区域疏水核心堆积显著减少（a和d位置分别降至48%和21%）。His30位于C末端a位置，埋藏率仅34%，表明超螺旋核心局部开放，有利于溶剂接近配位血红素。

3.3 静电相互作用与氢键

结构由链A的Glu20（e位）侧链羧酸根与链D的Lys10（b位）侧链铵基之间的分子间盐桥稳定。此外还观察到链A的Lys3（b位）与链B的Glu27（e位）之间的水介导氢键。四条链均呈现规则的链内主链氢键模式（CO_i ← HN_i+4），平均氢键距离为2.90-3.02 ?。APBS静电表面势计算揭示了四聚体上正负区域的显著分离，连续的带正电斑块沿g/g′界面分布，主要由反平行链A-B和C-D之间的Lys残基形成，而带负电斑块主要对应e/e′位置的Glu残基。晶格中形成了直径约30 ?的通道，由交替的正负电荷表面斑块衬里。

3.4 血红素

两个血红素辅因子各自位于一对平行螺旋之间：heme1位于链A和C之间，heme2位于链B和D之间。两个血红素均由各对螺旋的His30残基咪唑环的ε-氮原子配位，可视为天然电子传递血红素蛋白（如线粒体复合物的细胞色素b亚基）的结构模拟。Fe-N_His键长约2.0 ?，两个血红素共轭四吡咯环的边对边距离为38 ?。配位His残基采用明确的g^?/g⁺旋转异构态，His(N_ε)-Fe-His(N_ε)角度分别为173°（heme1）和178°（heme2），表明配体从卟啉平面上方和下方接近，呈近理想线性轴向配位。轴向His配体咪唑环平面间二面角分别为99°和108°，呈近似正交排列。血红素平面本身近似共面（平面角177°），两个血红素间存在67°的相对旋转偏移。血红素口袋部分水合，三个水分子介导丙酸基团与附近残基之间的氢键相互作用，丙酸基团与Lys29之间存在直接相互作用。Trp2的吲哚环相对于卟啉大环采用滑移平行取向，层间距约3.5-3.7 ?，符合有利的π-堆积相互作用。

3.5 与从头设计反平行四聚体及天然血红素蛋白的比较

与已报道的从头设计卷曲螺旋和螺旋束设计相比，该结构表现出更大的平均螺旋间距（对角15 ?，相邻7.5-13 ?），超过束状架构中通常观察到的值。与此扩展几何一致，每个残基平均可及表面积（ASA，70 ?²）高于大多数脱辅基和血红素结合四聚体（36-65 ?²），表明螺旋位移以适应双组氨酸配位血红素导致结构更加溶剂暴露且致密性降低。螺旋间盐桥数量低于相关体系，表明这些相互作用对本卷曲螺旋组装体的稳定性贡献有限。与脱辅基3SCC卷曲螺旋（PDB代码7N2Y）的比较表明，血红素结合后所有结构参数均发生改变。血红素以两种方式改变肽组装：第一，在所有pH范围内将平行3SCC转化为反平行4SCC；第二，在碱性pH下诱导滑移堆积。这些观察支持双组氨酸血红素配位发挥主导性结构导向作用的模型，补偿了次优堆积并实现了明确四聚体的形成。Fe-N(His)距离与已报道的从头设计和天然血红素蛋白结构相当，而His-His二面角（99°和108°）落在设计系统通常观察到的较窄范围内（约100-120°），但比天然蛋白中更受限制。

四、结论

该研究报道了碱性pH下血红素结合从头设计肽的高分辨率晶体结构，证明双组氨酸配位的血红素辅因子如何引导卷曲螺旋组装为明确的反平行四聚体。这一行为揭示了单一设计序列的结构可塑性，该序列此前已被证明可在最小支架内作为过氧化物酶、氯过氧化物酶和细胞色素P450单加氧酶的pH依赖性结构模拟物。单一序列能够采用多种寡聚状态、改变疏水堆积和螺旋注册，凸显了控制卷曲螺旋形成的微妙能量平衡。在此背景下，血红素辅因子可作为结构决定因素，稳定组装体同时决定寡聚状态、螺旋注册和超分子组织，并采用与天然电子传递蛋白一致的几何构型。这些发现为氧化还原活性人工金属蛋白的理性设计铺平了道路，同时也为旨在预测设计蛋白中替代寡聚状态和结构可塑性的计算方法提供了潜在的未来测试案例。该四聚体中观察到的注册位移在设计血红素蛋白中并不常见，体现了仅从序列评估难以预测的结构变异性类型。未来工作将探索利用这些4SCC中的双组氨酸配位血红素作为工程化电子传递位点。