《Pharmacological Research》：MAMDC2 drives microglia-mediated neuroinflammation via CAND1-dependent IκBα ubiquitination and is targetable by Artemvulactone E
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MAMDC2通过促进小胶质细胞活化驱动神经炎症；MAMDC2促进CAND1（cullin-associated and neddylation-dissociated 1）依赖性SCF（Skp1-Cullin1-F-box）调控及IκBα（inhibitor
MAMDC2通过促进小胶质细胞活化驱动神经炎症；MAMDC2促进CAND1（cullin-associated and neddylation-dissociated 1）依赖性SCF（Skp1-Cullin1-F-box）调控及IκBα（inhibitor of nuclear factor κB alpha）降解；Artemvulactone E（AE）与MAMDC2结合并减轻小胶质细胞炎症。
神经炎症（neuroinflammation）已被视为多种神经系统疾病的主动驱动因素，而非中枢神经系统（CNS）损伤后的被动结果。持续存在的小胶质细胞（microglia）活化可导致促炎介质释放、氧化应激及细胞因子介导的损伤，并逐步加重神经元功能障碍；慢性神经炎症是中枢神经系统感染及AD（Alzheimer’s disease，阿尔茨海默病）、PD（Parkinson’s disease，帕金森病）、MS（multiple sclerosis，多发性硬化）、ALS（amyotrophic lateral sclerosis，肌萎缩侧索硬化）等神经退行性疾病的共同病理特征。小胶质细胞活化受模式识别受体信号、干扰素相关反应以及NF-κB（nuclear factor kappa B，核因子κB）、MAPK（mitogen-activated protein kinase，丝裂原活化蛋白激酶）、JAK/STAT（Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，Janus激酶/信号转导与转录激活因子）等经典级联调控，泛素化则是控制炎症调节因子稳定性和活性的关键翻译后检查点。CAND1（cullin-associated and neddylation-dissociated 1，库林相关且neddylation解离蛋白1）可调控SCF（Skp1-Cullin1-F-box）E3连接酶复合物的组装与底物交换，并影响IκBα（inhibitor of nuclear factor κB alpha，核因子κB抑制蛋白α）稳定性和NF-κB活性，但其在小胶质细胞活化及神经炎症中的精确作用尚未充分明确。MAMDC2（MAM domain-containing 2，MAM结构域包含蛋白2）既往被认为与肿瘤生物学和发育相关，并参与CNS抗病毒天然免疫，但其是否驱动致病性促炎活化、涉及何种信号机制以及能否被药理学靶向仍不清楚。因此，研究人员围绕MAMDC2是否驱动小胶质细胞介导的神经炎症及其可靶向性开展研究。研究联合LPS（lipopolysaccharide，脂多糖）或HSV-1（herpes simplex virus type 1，单纯疱疹病毒1型）诱导的细胞与动物神经炎症模型，发现MAMDC2是小胶质细胞促炎反应的关键放大器并加重神经炎症损伤；机制上，MAMDC2与CAND1互作，促进SCF复合物组装，增强IκBα泛素化及降解，维持NF-κB活化及JAK2-STAT1信号；通过虚拟筛选鉴定AE为可直接结合MAMDC2的小分子，AE以高亲和力结合MAMDC2并破坏MAMDC2-CAND1互作，从而抑制小胶质细胞炎症反应并减轻体内神经炎症病理。该研究将MAMDC2识别为小胶质细胞炎症反应此前未被认识的调控因子，并提示AE是治疗神经炎症性疾病的潜在先导化合物。论文发表在《Pharmacological Research》。
关键技术：单细胞数据集GSE157827、GSE243639及RNA-seq数据GSE349479；BV-2（Kunming Cell Bank）、HMC3（ATCC CRL-3304）、原代小胶质细胞（新生C57BL/6J小鼠）、MAMDC2缺陷小鼠（Cyagen，C57BL/6NCya-Mamdc2
em1/Cya）及CRISPR/Cas9 RNP敲除BV-2细胞；LPS、HSV-1和MPTP（1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶）模型；Co-IP（免疫共沉淀）联合LC-MS/MS、CETSA（细胞热位移分析）、SPR（表面等离子体共振）、分子对接/动力学模拟、虚拟筛选、流式细胞术、免疫荧光、Western blot、RT-qPCR、ELISA及行为学/组织学分析。
3.1 MAMDC2在神经炎症小鼠脑内上调：研究人员分析AD和PD公共单细胞转录组数据，发现MAMDC2在包括小胶质细胞在内的多类脑细胞中表达，并与部分小胶质细胞炎症及疾病相关转录程序相关；在系统性LPS、立体定位LPS、HSV-1脑炎及慢性MPTP模型脑组织中，Mamdc2/MAMDC2表达升高，并主要定位于IBA-1阳性激活小胶质细胞。结论：MAMDC2上调与多种神经炎症模型中的小胶质细胞活化密切相关。
3.2 MAMDC2增强小胶质细胞炎症反应：LPS刺激BV-2细胞后Mamdc2 mRNA在2–3 h内快速诱导；MAMDC2过表达增强LPS诱导的IL-6、TNF-α分泌及HSV-1诱导的IL-6释放，并提高iNOS、COX-2水平；Mamdc2敲低或敲除降低IL-1β、IL-6、TNF-α及iNOS、COX-2表达和分泌；原代小胶质细胞中结果一致。结论：MAMDC2正向调控小胶质细胞促炎活化。
3.3 MAMDC2促进NF-κB信号激活：对LPS刺激且Mamdc2敲低的BV-2细胞进行RNA-seq和GSEA（gene set enrichment analysis，基因集富集分析），发现TNFα/NF-κB信号和炎症反应基因集显著负富集；Western blot、核质分离和免疫荧光显示MAMDC2过表达增强p65、JAK2、STAT1磷酸化并降低IκBα，敲低则降低p65和STAT1磷酸化及核转位；STING抑制剂不影响MAMDC2诱导的NF-κB活化，BMS-345541和fludarabine实验提示STAT1位于NF-κB下游，ERK/JNK磷酸化不受影响。结论：MAMDC2主要以NF-κB通路为主轴，并促进STAT1信号以放大激活小胶质细胞的炎症转录程序。
3.4 MAMDC2促进IκBα的泛素依赖性降解：时间进程和CHX chase实验显示MAMDC2加速IκBα降解；MG132而非氯喹阻断MAMDC2介导的IκBα减少，提示泛素-蛋白酶体系统参与；GSEA显示Mamdc2敲低后K48连接泛素化和蛋白多泛素化基因集负富集；Co-IP显示MAMDC2促进IκBα K48连接多泛素化，K22R和K21/22R突变降低该效应，K21R影响较小。结论：MAMDC2促进IκBα K48连接多泛素化及蛋白酶体降解，从而激活NF-κB信号。
3.5 MAMDC2与CAND1互作促进IκBα降解：Co-IP联合LC-MS/MS鉴定CAND1为MAMDC2互作蛋白，蛋白对接、分子动力学模拟、双向Co-IP及免疫荧光共定位验证二者互作；CAND1过表达加速IκBα降解并增强炎症介质表达，CAND1促IκBα泛素化被Mamdc2敲低削弱；MAMDC2增强CAND1与Cullin1结合，并促进Cullin1与β-TrCP及IκBα结合。结论：MAMDC2通过与CAND1互作促进SCF依赖性IκBα泛素化和降解。
3.6 MAMDC2基因缺失减轻体内神经炎症：研究人员构建MAMDC2缺陷小鼠（Mamdc2
?/?），其生长及主要器官形态无明显异常；立体定位LPS模型中，MAMDC2缺失降低IL-6、Il-1β表达，改善开放场和爬杆实验运动表现，抑制IκBα降解，减轻纹状体和黑质致密部组织病理及IBA-1阳性小胶质细胞活化。结论：MAMDC2基因缺失减轻LPS诱导的神经炎症和运动功能障碍。
3.7 AE靶向MAMDC2并抑制小胶质细胞炎症：对A. vulgaris来源抗炎成分进行虚拟筛选，AE（Compound 3）抑制效果最强；CETSA和SPR显示AE与MAMDC2直接结合，K
D约0.2 μM；在非细胞毒浓度下，AE降低LPS或HSV-1诱导的IL-6、TNF-α、iNOS和COX-2表达，原代小胶质细胞中结果一致；条件培养基转移实验显示AE减轻小胶质细胞炎症毒性所致SH-SY5Y细胞死亡；MAMDC2敲低削弱AE作用，LC-MS/MS、分子对接/动力学和C632A突变提示Cys632参与AE-MAMDC2结合。结论：AE靶向MAMDC2并抑制小胶质细胞炎症及炎症相关神经毒性。
3.8 AE破坏MAMDC2-CAND1轴：AE抑制LPS诱导的p65和STAT1磷酸化及核转位，减少MAMDC2相关IκBα泛素化，减弱MAMDC2-CAND1互作以及CAND1/β-TrCP与Cullin1结合，并降低Cullin1 neddylation；MAMDC2缺陷细胞中AE的额外抑制效应减弱，C632A突变削弱AE对p65磷酸化和IκBα丢失的作用。结论：AE通过破坏MAMDC2-CAND1轴，损害Cullin1/β-TrCP复合物组装和Cullin1 neddylation，从而限制IκBα泛素化及NF-κB活化。
3.9 AE抑制LPS诱导的体内神经炎症：AE重复给药未明显影响体重、血清ALT、AST、尿素、肌酐、外周白细胞谱及主要器官组织学；腹腔给药后脑/血清浓度比大于1，提示脑穿透；立体定位LPS模型中，AE降低Il-1β和IL-6表达，改善运动表现，降低IBA-1、IκBα降解及p65/STAT1磷酸化，减轻小胶质细胞活化并缓解NeuN信号丢失。结论：AE在体内减轻LPS诱导的神经炎症和神经元损伤。
3.10 AE改善MPTP诱导的神经炎症和多巴胺能损伤：慢性MPTP模型中，AE剂量依赖性改善运动缺陷，5 mg/kg作用更明显；AE部分恢复外周炎症细胞谱，保留黑质纹状体TH免疫反应，降低IBA-1信号及NF-κB/IκBα信号；Mamdc2缺陷本身改善MPTP诱导的行为障碍、TH免疫反应丢失和小胶质细胞活化，而AE在Mamdc2缺陷小鼠中的额外获益有限。结论：AE减轻慢性MPTP诱导的神经炎症和黑质纹状体损伤，MAMDC2参与AE的体内保护作用。
讨论部分总结：该研究将MAMDC2确定为小胶质细胞介导神经炎症的正调控因子，其作用超出既往已报道的抗病毒防御功能，表现为STING非依赖、以NF-κB为中心的促炎程序；MAMDC2与CAND1互作，促进SCF复合物组装、Cullin1 neddylation及IκBα K48连接多泛素化降解；MAMDC2并非炎症启动触发因子，而是危险或病原刺激依赖性的炎症放大器；AE作为天然来源小分子直接结合MAMDC2，Cys632参与结合。讨论也指出局限：体内研究采用全身Mamdc2敲除且仅使用雄性小鼠，MAMDC2-CAND1精细结合界面、AE选择性/药代/长期安全性及其他神经退行模型中的作用仍需进一步研究。
研究结论翻译：综上所述，研究结果将MAMDC2鉴定为小胶质细胞炎症的刺激响应性放大器，并将其功能与CAND1依赖性SCF介导的IκBα周转调控联系起来。通过促进IκBα K48连接多泛素化和蛋白酶体降解，MAMDC2在炎症条件下维持NF-κB信号。AE干扰MAMDC2-CAND1轴并在细胞和动物模型中减弱该信号级联，而其在Mamdc2缺陷背景下疗效降低进一步支持MAMDC2对AE药理作用的功能贡献。总之，这些发现拓展了对MAMDC2既往抗病毒信号作用的认识，并突出泛素连接酶组装动态调控是控制小胶质细胞炎症放大的一种重要机制，也为将MAMDC2-CAND1轴作为神经炎症相关疾病潜在干预点提供机制依据。
