大豆生物钟相关基因GmRVE8b调控开花期与成熟期的功能解析

《Plant Science》：A circadian clock-associated gene GmRVE8b modulates flowering time and maturity in soybean

　　

全基因组关联分析（genome-wide association study，GWAS）和深度学习（deep learning，DL）提示GmRVE8b是一个大豆成熟期位点。GmRVE8b单倍型与成熟期和区域适应性相关。过表达GmRVE8b延迟大豆开花和成熟。GmRVE8b可能通过GmELF3–E1/E1La–FT4模块发挥作用。针对GmRVE8b的遗传操作可能有助于改善大豆的广域适应性。

大豆（Glycine max (L.) Merr.）是典型的短日植物，其光周期敏感性显著限制了品种的地理适应范围，导致商业种植集中于较窄的纬度带，制约了栽培面积的扩大和全球产量的稳定。在高纬度长日条件下，品种需早花早熟以避免霜冻；在低纬度短日条件下，品种需延迟开花以延长营养生长期、提高生物量积累和产量潜力。因此，开花期和成熟期是决定大豆区域适应性、生产力和产量稳定性的关键农艺性状。已知大豆中存在多个控制成熟期的位点，如E1–E11、J及FT家族成员，其中E1编码B3结构域转录因子，是光周期开花途径的核心抑制因子，在长日下直接抑制成花素基因GmFT2a和GmFT5a的表达。E1的两个同源基因GmE1La和GmE1Lb与E1协同抑制开花，但其上游调控机制仍不清楚。此外，生物钟核心组分如E2（GIGANTEA同源基因）、J（GmELF3）和GmLUX等通过调控E1表达参与光周期开花调控，表明生物钟在大豆开花和生长周期中具有重要作用。然而，RVE家族基因在大豆中的功能，尤其是对光周期开花和成熟期的调控作用，尚未得到系统解析。

该研究整合全基因组关联分析和深度学习方法，对257份大豆种质进行重测序和遗传分析，鉴定到13号染色体上稳定的成熟期相关数量性状位点，并确定候选基因Glyma.13G136300，经序列比对和保守结构域分析将其命名为GmRVE8b。随后通过单倍型分析、亚细胞定位、组织与昼夜表达分析以及转基因过表达功能验证，发现GmRVE8b是延迟大豆开花和成熟的新负调控因子，并可能与GmELF3–E1/E1La–FT4光周期调控模块相关。该研究为理解生物钟介导的大豆光周期开花网络提供了新视角，也为培育广适性品种提供了潜在分子靶点。

研究人员采用的主要技术方法包括：对257份大豆种质（含10份野生大豆、33份地方品种、214份栽培大豆，来自中国农业科学院作物科学研究所）进行全基因组重测序，平均深度约9×，获得2,757,937个高质量SNP；利用FarmCPU方法开展GWAS，结合深度学习工具DeepGOPlus预测候选基因功能；对编码区变异进行单倍型分析；通过本氏烟草（Nicotiana benthamiana）瞬时表达进行亚细胞定位；构建GmRVE8b过表达载体转化大豆品种Jack，获得T3代纯合转基因株系；采用qRT–PCR分析基因表达。

3.1 大豆种质资源的重测序与基因组变异分析
对257份大豆材料进行全基因组重测序，平均清读深度9×，比对率94%，系统发育分析将材料分为东北、黄淮海和南方三个遗传类群，与我国大豆主产区高度一致。

3.2 通过GWAS鉴定成熟期相关QTL
成熟期性状VE-R7（出苗至生理成熟天数）在群体中呈连续分布，且在不同年份间表现稳定。GWAS在13号染色体上检测到稳定显著的QTL（-log₁₀P ≥ 6），另在19号染色体上检测到已知的GmFT5b等位点。连锁不平衡分析确定13号染色体候选区间为97.94 kb，含9个注释基因。

3.3 鉴定与成熟期相关的新遗传位点
对候选区间基因进行qRT–PCR表达分析，在短日照（SD）和长日照（LD）条件下，仅Glyma.13G135800、Glyma.13G135900、Glyma.13G136300和Glyma.13G136400呈现光暗周期依赖的表达变化；DeepGOPlus功能预测进一步显示，其中仅Glyma.13G136300与成熟期相关生物学过程有关。组织表达分析表明该基因主要在复叶、花和茎中积累。蛋白序列含有典型MYB结构域和RVE8亚家族保守残基，与已知RVE8直系同源蛋白高度相似，因此命名为GmRVE8b。

3.4 自然变异和单倍型分析
GmRVE8b编码区检测到6个SNP，构成5种单倍型。其中早熟单倍型GmRVE8bH1主要分布在北方（NR），晚熟单倍型GmRVE8bH3主要分布在南方（SR）。在全部测试环境中，携带GmRVE8bH3的品系成熟期显著晚于GmRVE8bH1，差异可能与第154位保守氨基酸替换有关。

3.5 亚细胞定位
在烟草叶片中瞬时表达GmRVE8b–GFP融合蛋白，绿色荧光与核标记mCherry–NLS共定位，证明GmRVE8b定位于细胞核，提示其可能在核内执行调控功能。

3.6 GmRVE8b过表达植株延迟开花和成熟
构建CaMV35S启动子驱动的GmRVE8b（H3型）过表达载体并转化Jack，获得3个T3纯合株系（GmRVE8b-OE），其表达量较野生型提高16–23倍。在SD和LD条件下，OE株系开花延迟6–7天，成熟延迟8–10天；在自然长日（NLD）条件下（北京、新乡，2023和2025年），开花延迟6–8天，成熟延迟10–11天。同时，营养生长期与生殖生长期比值（R/V）显著降低，表明GmRVE8b延迟了营养生长向生殖生长的转变。

3.7 GmRVE8b可能与GmELF3–E1/E1La–FT4光周期调控模块相关
在GmRVE8b-OE株系中，E1、GmE1La和GmFT4的转录水平显著上调，而GmELF3显著下调，GmLUX1和GmLUX2无明显变化。这表明GmRVE8b可能通过影响GmELF3–E1/E1La–FT4模块来调控开花和成熟。

讨论部分指出，GmRVE8b是此前未表征的大豆开花和成熟负调控因子，可能主要通过调节GmELF3–E1/E1La–FT4模块发挥作用。此外，GmRVE8b-OE株系茎秆毛状体密度明显增加，但其机制和生物学意义尚待明确。单倍型地理分布支持了该基因在大豆纬度适应性中的潜在价值：北方以早熟H1为主，南方以晚熟H3为主。因此，在低纬度短日地区，利用晚花的H3单倍型或过表达GmRVE8b可避免过早开花、延长营养生长；在高纬度长日地区，利用早花的H1单倍型或敲除GmRVE8b可缩短生育期，确保霜前成熟。该研究也存在局限性：尚未直接验证GmRVE8b的转录因子活性，对GmELF3–E1/E1La–FT4模块的调控关系主要基于表达分析，有待遗传和生化证据进一步确认。总体而言，该研究将GmRVE8b鉴定为大豆开花和成熟期的候选基因，揭示了自然变异可能促进品种跨纬度适应的机制，为后续分子育种提供了有价值的目标位点。