羟基化单萜类中α-松油醇激活番茄细菌防御并驱动茉莉酸依赖的自我放大免疫及田间病害保护

《Plant Stress》：Hydroxylated monoterpenes activate tomato defence pathways against bacteria to trigger jasmonate-dependent self-amplifying immunity

　　

羟基化单萜类（hydroxylated monoterpenes, HMTPs）在抗性番茄与Pseudomonas syringae互作期间释放，并赋予抗菌抗性，但其整合入免疫信号的过程仍知之甚少。研究人员在此显示，HMTPs作为内源信号参与番茄经典防御通路，重演病原攻击响应的关键方面。以α-松油醇（α-terpineol）作为代表性HMTP，研究人员证明该挥发物激活促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MPK）激酶、钙和活性氧（reactive oxygen species, ROS）依赖的信号，促进茉莉酸（jasmonate, JA）和水杨酸（salicylic acid, SA）积累，并以不依赖脱落酸（abscisic acid, ABA）的方式诱导病原体样气孔免疫。功能分析揭示，HMTP生物合成依赖ROS和JA信号，且HMTPs进一步促进其自身积累，建立自我强化的前馈机制。此外，体外氧化条件驱动HMTPs间化学重塑和选择性互变，促进挥发物多样化并有利于高生物活性羟基化形式的积累。与此一致，氘标记芳樟醇被整合入植物代谢并在in planta转化为氘代α-松油醇，为挥发物互变提供直接证据。重要的是，马铃薯田间试验显示，α-松油醇显著降低由卵菌病原Phytophthora infestans引起的病害严重度。综上，研究人员的发现确立HMTPs为植物免疫的动态放大器，将病原响应防御通路激活、JA依赖自我放大、氧化还原驱动挥发物多样化及园艺作物田间相关病害保护相联系。

植物与病原互作中，早期免疫涉及ROS爆发、胞质钙（Ca²⁺）瞬变和MPK级联，水杨酸（SA）与茉莉酸（JA）通路是免疫调控核心；萜类经甲羟戊酸（MVA）和甲基赤藓醇磷酸（MEP）通路合成，并可经细胞色素P450单加氧酶（CYP）氧化形成HMTPs。番茄HMTPs如α-松油醇、芳樟醇和terpinen-4-ol在识别细菌触发效应子触发免疫（ETI）时差异释放，但α-松油醇的生化来源未明，番茄萜烯合酶（TPS）家族中未描述萜品醇合酶活性；HMTP如何整合入免疫信号亦不清楚。研究人员以α-松油醇为代表，整合转录组、代谢组、生化、药理与遗传分析、钙成像、同位素标记及田间试验，解析其防御激活、上游生物合成调控、自我放大和化学互变。结论表明，HMTPs作为内源信号激活类似Pseudomonas syringae pv. tomato（Pst；番茄细菌性斑点病病原）感染的转录程序，经Ca²⁺/ROS/MPK依赖且非ABA方式诱导气孔免疫；JA和ROS上游调控HMTP生物合成，HMTPs自我促进积累，氧化条件驱动非酶化学重塑，氘标记芳樟醇在in planta转化为氘代α-松油醇；田间α-松油醇降低马铃薯晚疫病严重度。该研究将HMTPs定位为连接防御通路、JA依赖自我放大、氧化还原驱动挥发物多样化和田间保护的免疫动态放大器。

方法概括：所用材料包括番茄Rio Grande（携带Pto）、Money Maker、spr2及其亲本Castlemart、NahG及其亲本MM；拟南芥包括pMAPKKK18-LUC⁺、mpk3、mpk6、rbohD、GCaMP3及glr3.1/3.3/3.6等；田间为马铃薯cv. Spunta。关键技术包括RNA-seq与RT-qPCR、UPLC-MS/Orbitrap代谢组、GC-MS/HS-SPME挥发物分析、药理学抑制剂与遗传突变体气孔及抗性实验、GCaMP3胞质Ca²⁺成像、氘标记linalool-d₃体内转化、H₂O₂体外化学转化及田间晚疫病严重度与 efficacy 试验。

结果部分：1. α-松油醇诱导类似Pseudomonas syringae感染的转录重编程。RNA-seq比较α-松油醇处理、Pst感染及对照，α-松油醇调节5,809个差异表达基因，Pst为2,742个，二者共享44.6%，Pearson r=0.74；GO富集SA信号、防御响应、系统获得性抗性（SAR）、JA生物合成、乙烯响应、Ca²⁺稳态及萜类/MVA通路；RT-qPCR验证免疫标记基因。结论为α-松油醇激活与感染重叠的广泛转录防御程序。2. α-松油醇通过核心防御信号通路诱导病原体样气孔关闭。叶盘气孔实验结合EGTA、PD98059、DPI、SHAM、NAC处理显示，EGTA完全阻断，PD98059和DPI部分抑制，NAC阻断α-松油醇与flg22诱导的气孔关闭，SHAM不影响ABA和α-松油醇效应；拟南芥glr3.1/3.3/3.6部分敏感，mpk3、mpk6、rbohD完全不敏感；pMAPKKK18-LUC⁺未诱导、ABA水平不变；GCaMP3显示[Ca²⁺]_cyt快速瞬变并由处理叶传至远端叶，glr突变体叶身无变化。结论为α-松油醇经Ca²⁺、MPK和NADPH氧化酶依赖ROS诱导非ABA气孔免疫与长距离Ca²⁺信号。3. α-松油醇通过激素与代谢重编程协调多层免疫。转录组显示JA、SA和赤霉素（GA）通路激活，激素定量确认JA、SA、GA₁和GA₄积累；UPLC-MS/Orbitrap代谢组显示抗坏血酸、脯氨酸、核糖醇、烟酸、香豆酰多巴胺、阿魏酰多巴胺及12-氧代植物二烯酸（OPDA）增加；GC-MS显示绿色叶片挥发物（GLVs）等防御相关挥发物增加。结论为α-松油醇协调激素与特化代谢形成多层免疫状态。4. JA信号调控植物防御中的HMTP生物合成。NAC、EGTA、DPI降低HMTP含量，PD98059和SHAM无此作用；外源SA不诱导HMTP，ABT无影响，NahG与野生型相当；MeJA促进HMTP积累，DIECA降低，spr2突变体HMTP减少。结论为Ca²⁺和ROS位于上游，JA是HMTP积累的主要激素调节因子，SA不关键。5. HMTPs通过生物合成激活和化学互变建立自我强化反馈环。α-松油醇处理增加terpinen-4-ol，芳樟醇处理增加三种HMTPs，limonene无显著变化；MEP通路基因MDS、IDI2、DXS3a受诱导；H₂O₂增加HMTPs；linalool-d₃转化为α-terpineol-d₃；体外H₂O₂使芳樟醇减少并出现含α-松油醇的HMTP峰；spr2中H₂O₂诱导HMTP积累缺失。结论为HMTPs经转录反馈和氧化驱动非酶化学互变自我放大，且ROS诱导积累需要JA生物合成能力。6. 时间动态支持防御期间HMTP持续自我强化积累。avr Pst时间进程显示α-松油醇和芳樟醇在10 dpi最高，hexenal、limonene和phellandrene变化较小或下降；早期18–48 h已上升；密封与开放条件下24 h和72 h水平相当，排除被动滞留；TPS5早期高表达，MEP通路基因瞬时诱导。结论为HMTP持续积累符合自我强化，涉及早期生物合成激活与后续化学多样化。7. α-松油醇介导的免疫转化为田间对Phytophthora infestans的保护。马铃薯田间试验比较α-松油醇、Curenox和未处理对照，α-松油醇显著降低晚疫病严重度，Abbott efficacy为54.5%–75.0%，Curenox为57.0%–84.5%，试验浓度下未见可检测药害。结论为α-松油醇在田间对卵菌病原提供实质保护。

讨论部分总结：HMTPs是防御核心因子，但其免疫信号整合长期未明；α-松油醇重演Pst防御并诱导更广泛转录重编程，GO富集防御和特化代谢；其气孔关闭不依赖ABA，符合ROS/Ca²⁺介导的替代防御框架；Ca²⁺波传播提示长距离防御信号参与。JA与SA同时积累，二者互作具上下文依赖性，JA对ETI后系统免疫建立重要；α-松油醇重塑特化代谢并增加抗氧化、细胞壁强化相关代谢物及OPDA。药理与遗传结果表明ROS和JA信号为HMTP积累所需，JA与HMTP双向关系构成自我强化免疫回路。化学重塑为新机制：氧化条件足以促进HMTPs非酶互变，氘标记证明in planta芳樟醇向α-松油醇转化，氧化重塑偏向高活性α-松油醇；但酶与非酶贡献、中间体及H₂O₂精确作用仍未解决。时间分析支持HMTPs在ETI中持续积累并维持挥发物防御。田间试验支持α-松油醇作为天然防御诱导剂的应用潜力。

研究结论翻译：综上，研究数据支持如下模型：病原触发的Ca²⁺和ROS信号在防御响应中促成JA依赖的HMTP积累；免疫激活相关氧化环境可能促进HMTP库内化学重塑，选择性富集高生物活性化合物如α-松油醇。一旦积累，α-松油醇激活MPK、ROS和Ca²⁺依赖信号通路，触发防御相关转录、代谢和挥发物重编程，并在远端组织传播胞质Ca²⁺波；同时，HMTPs通过JA依赖前馈环促进自身积累，从而随时间维持挥发物产生和免疫激活。在此背景下，HMTPs不仅参与局部抗菌响应，也可能参与维持和放大持久系统免疫信号。α-松油醇在田间显著降低马铃薯由卵菌病原P. infestans引起的晚疫病严重度，表明该机制的保护相关性超越番茄-Pst病理系统。上述发现将HMTPs、尤其α-松油醇定位为植物免疫的动态放大器和园艺作物保护中有前景的天然防御诱导剂，连接免疫信号、氧化还原驱动挥发物多样化、持久防御激活和田间相关抗病性。