《Poultry Science》：Regulating miR-138-5p/SIRT1 axis by Dihydromyricetin alleviates LPS-induced oxidative stress and inflammation in chicken liver damage
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脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌外膜的主要结构成分，可经门静脉到达肝脏，触发炎症反应和氧化应激，最终导致肝损伤。二氢杨梅素（DHM）是一种天然黄酮类化合物，具有保肝、抗炎和抗氧化等多种生物活性。然而，DHM能否通过调控SIRT1（沉默信息调节因子1）减轻LPS诱
脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌外膜的主要结构成分，可经门静脉到达肝脏，触发炎症反应和氧化应激，最终导致肝损伤。二氢杨梅素（DHM）是一种天然黄酮类化合物，具有保肝、抗炎和抗氧化等多种生物活性。然而，DHM能否通过调控SIRT1（沉默信息调节因子1）减轻LPS诱导的鸡肝损伤及其潜在分子机制尚不清楚。本研究以鸡和鸡原代肝细胞为实验模型，探讨SIRT1在LPS诱导肝损伤中的作用，并阐明miR-138-5p靶向调控SIRT1的分子机制。研究结果表明，DHM在体内和体外均可通过降低氧化应激和炎症减轻鸡肝损伤；LPS通过加速miR-138-5p转录抑制SIRT1表达，从而加重肝损伤；DHM激活SIRT1及其下游NOX4（NADPH氧化酶4）和PPARα（过氧化物酶体增殖物激活受体α）以抑制活性氧（ROS）产生；DHM逆转miR-138-5p对SIRT1的抑制作用，缓解ROS释放和炎症因子分泌，从而抑制LPS诱导的肝损伤。综上，DHM通过激活SIRT1并调控miR-138-5p改善LPS诱导的鸡肝损伤。本研究首次探讨了miR-138-5p介导的SIRT1调控在鸡LPS诱导肝损伤中的分子机制，以及DHM对LPS诱导肝氧化应激的保护作用，为DHM在兽医领域的推广应用提供了理论基础，并为减少鸡肉药物残留、缓解抗菌药物耐药性、最终提高禽产品安全性提供了新思路。
论文解读
一、研究背景与科学问题
肝损伤可由病原感染、营养代谢紊乱和药物滥用等多种因素引起。随着家禽养殖规模的扩大，细菌感染已成为重大挑战，造成巨大经济损失并构成公共卫生风险。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌外膜的主要结构成分，在细菌感染过程中，细菌裂解释放LPS，经门静脉到达肝脏，触发炎症反应和氧化应激，最终导致肝损伤。集约化家禽养殖的高饲养密度增加了鸡对LPS暴露的易感性。因此，寻找有效治疗药物和策略以减轻LPS诱导的鸡肝损伤具有重要意义。
天冬氨酸氨基转移酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）与肝细胞损伤密切相关。LPS破坏氧化还原稳态，损害活性氧（ROS）清除能力，最终导致氧化损伤。过度氧化应激还可促进促炎细胞因子（如白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α））的分泌。沉默信息调节因子1（SIRT1）作为重要的抗氧化防御调节因子，在减轻LPS诱导肝损伤中发挥关键作用。SIRT1可抑制NADPH氧化酶4（NOX4）并激活过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα），通过限制ROS产生和促进ROS清除的双重机制抑制氧化应激。已有研究表明，多种微小RNA（miRNA）可通过抑制SIRT1加重肝损伤。其中，miR-138-5p被证实参与SIRT1的调控。二氢杨梅素（DHM）是一种天然黄酮类化合物，具有保肝、抗炎和抗氧化等生物活性，且已被证明可激活SIRT1介导的保护机制。然而，DHM对LPS诱导鸡肝损伤的保护作用是否依赖于SIRT1，以及miR-138-5p是否参与其中，尚缺乏系统研究。本研究旨在阐明DHM通过调控miR-138-5p/SIRT1轴减轻LPS诱导鸡肝损伤的分子机制。
二、主要技术方法
研究人员以24只海兰白雏鸡（购自中国哈尔滨先锋养鸡场）为体内实验对象，随机分为对照组、0.1% DHM组、LPS组和DHM+LPS组，通过腹腔注射LPS（60 mg/kg，大肠杆菌111 O55:B5）建立鸡肝损伤模型。体外实验采用SPF鸡胚原代肝细胞，以LPS（40 μg/mL）处理12小时，DHM预处理2小时。主要技术方法包括：苏木精-伊红（H&E）染色和透射电子显微镜（TEM）进行组织病理学和超微结构分析；生化指标检测（AST、ALT、LDH、SOD、GSH、GSH-Px、CAT、MDA、H?O?、NO）；酶联免疫吸附测定（ELISA）检测炎症因子；RT-qPCR检测基因表达；蛋白质印迹（WB）检测蛋白表达；双荧光素酶报告基因实验验证miR-138-5p与SIRT1的靶向关系；构建pcDNA3.1-SIRT1真核表达载体实现SIRT1过表达。
三、研究结果
DHM改善LPS诱导鸡的肝损伤。 H&E染色显示，LPS处理组鸡肝出现轻微出血和炎症细胞浸润，DHM处理显著减轻这些组织病理学改变。TEM观察显示，LPS组出现核膜严重破坏、核周间隙扩张、内质网和线粒体广泛空泡化及细胞内糖原耗竭，DHM处理显著改善上述超微结构异常。生化分析表明，LPS暴露显著降低血清SOD、GSH、GSH-Px和CAT水平，同时升高AST、ALT、LDH、MDA、H?O?和NO水平，DHM处理逆转了这些变化。此外，DHM还降低了LPS诱导的IL-6、TNF-α和IL-1β的产生和释放。
DHM改善LPS诱导鸡原代肝细胞损伤。 PAS染色证实分离的肝细胞具有高糖原合成能力。与体内结果一致，DHM处理显著提高LPS处理原代肝细胞中SOD、GSH、GSH-Px和CAT水平，同时降低AST、ALT、LDH和MDA水平。DHM还显著抑制了LPS诱导的过量ROS产生，并降低炎症因子的转录和分泌。
DHM促进鸡和原代肝细胞中SIRT1的表达。 LPS暴露显著降低鸡肝组织和原代肝细胞中SIRT1 mRNA和蛋白表达，DHM处理逆转了这一降低。研究人员成功构建了pcDNA3.1-SIRT1过表达载体，转染原代肝细胞后证实SIRT1在mRNA和蛋白水平均成功过表达。
SIRT1过表达抑制LPS诱导的原代肝细胞肝毒性。 LPS暴露降低GSH-Px、SOD、CAT和GSH水平，升高MDA、AST、LDH和ALT水平，SIRT1过表达显著减轻这些改变。SIRT1过表达还抑制了LPS诱导的ROS积累和炎症反应。进一步研究发现，LPS增加NOX4 mRNA和蛋白表达，SIRT1过表达抑制了这一增加；而PPARα表达在pcDNA3.1-SIRT1转染后显著增强。免疫荧光分析表明，NOX4抑制剂或PPARα激活剂处理均可显著减弱LPS诱导的ROS积累。
LPS通过miR-138-5p影响鸡和原代肝细胞中SIRT1的表达。 生物信息学预测发现gga-miR-138-5p在SIRT1 mRNA 3′-非翻译区（3′-UTR）存在潜在结合位点。LPS刺激增加miR-138-5p表达。双荧光素酶报告基因实验证实miR-138-5p与SIRT1存在直接靶向关系。miR-138-5p模拟物抑制SIRT1 mRNA和蛋白表达，而miR-138-5p抑制剂恢复其表达。miR-138-5p抑制可逆转LPS诱导的SIRT1表达降低。
SIRT1抑制消除了miR-138-5p敲低对LPS诱导肝细胞损伤的改善作用。 与LPS组相比，miR-138-5p抑制提高了SOD、GSH、GSH-Px和CAT水平，降低了AST、ALT、LDH和MDA水平，但这些保护作用被SIRT1抑制剂EX527逆转。miR-138-5p抑制显著减弱LPS诱导的ROS积累和炎症反应，EX527同样抵消了这些效应。
DHM通过降低miR-138-5p表达减轻LPS诱导的鸡和原代肝细胞损伤。 DHM抑制了LPS诱导的miR-138-5p上调。在miR-138-5p模拟物转染的细胞中，DHM处理逆转了SOD、GSH、GSH-Px和CAT水平的降低及AST、ALT、LDH和MDA水平的升高；但在miR-138-5p抑制剂转染的细胞中，DHM未产生显著的额外效应。miR-138-5p过表达增加ROS积累，DHM处理减弱了ROS积累，但在miR-138-5p抑制剂组中DHM的额外保护作用有限。DHM的抗炎作用同样与miR-138-5p抑制相关。
DHM通过调控miR-138-5p与SIRT1的关系抑制LPS诱导的肝细胞损伤。 miR-138-5p模拟物抑制SIRT1表达，pcDNA3.1-SIRT1转染恢复SIRT1表达。DHM提高SOD、GSH、GSH-Px和CAT水平并降低AST、ALT、LDH和MDA水平，但这些保护作用被miR-138-5p过表达减弱，随后被pcDNA3.1-SIRT1转染恢复。miR-138-5p过表达削弱了DHM对LPS诱导ROS积累的抑制作用，而SIRT1过表达进一步减少了ROS积累。炎症反应方面呈现相似模式。
四、讨论与结论
讨论部分指出，SIRT1在减轻LPS诱导的氧化应激和炎症中发挥关键作用。多种天然化合物可通过激活SIRT1减轻LPS诱导的毒性。白藜芦醇作为公认的SIRT1激活剂，可通过调控NOX1/SIRT1通路减轻LPS诱导的肠道损伤。槲皮素作为与DHM同类的黄酮类化合物，可通过激活SIRT1/Nrf2/GPX4通路减轻LPS诱导的急性肺损伤。DHM作为一种来源于藤茶的绿色健康天然化合物，具有资源丰富、获取容易、制备工艺相对简单等优势。预实验发现DHM在不同时间和剂量下对鸡肝细胞增殖具有良好的促进作用，适合作为鸡养殖中的饲料添加剂。本研究通过TargetScan分析预测了miR-138-5p在SIRT1 3′-UTR内的潜在结合位点，双荧光素酶报告基因实验证实了二者的直接靶向关系。DHM通过抑制LPS诱导的miR-138-5p上调，增强SIRT1表达，从而减轻鸡肝脏氧化应激和炎症反应。
研究结论部分指出，DHM主要通过减轻氧化应激和炎症来缓解LPS暴露引起的鸡肝损伤。这些保护作用可能通过下调miR-138-5p和上调SIRT1介导。具体而言，miR-138-5p/SIRT1信号轴的调控可能有助于降低MDA、ROS、TNF-α、IL-1β和IL-6水平，同时增强SOD和CAT活性、GSH-Px活性及GSH含量。综上所述，DHM有望作为保护鸡免受LPS介导肝损伤的膳食饲料添加剂。该研究首次探讨了miR-138-5p介导的SIRT1调控在鸡LPS诱导肝损伤中的分子机制，为DHM在兽医临床的推广应用提供了理论基础，并为减少禽产品药物残留、缓解抗菌药物耐药性、提高食品安全提供了新思路。
