DNAzyme触发HCR/CRISPR-Cas12a级联双模式读取生物传感器用于Pb2+超灵敏检测

《Sensing and Bio-Sensing Research》：DNAzyme triggered HCR/CRISPR-Cas12a cascade with dual-mode readout for ultrasensitive Pb2+ detection

构建了一种用于Pb²⁺检测的具有双模式读取的新型预组装生物传感器。该传感器实现了0.31 pM的超低检测限（limit of detection，LOD）。该生物传感器表现出强抗干扰能力、良好的批次重现性和可接受的冷藏稳定性。其检测结果与16个真实样品（real samples）的电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）数据表现出良好的一致性。

铅（Pb²⁺）是环境中毒性最强的不可生物降解重金属污染物之一，长期低剂量暴露可在人体器官中蓄积并诱发不可逆的神经系统损伤，儿童对铅诱发的发育性认知损伤尤为敏感。世界卫生组织（World Health Organization，WHO）建议饮用水中Pb²⁺的指导限值为10 μg/L。目前Pb²⁺定量依赖电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）、原子吸收光谱（AAS）和原子荧光光谱（AFS）等仪器技术，然而这些方法需要昂贵设备、熟练操作人员、耗时的样品消解和集中化测试，难以满足常规环境监测和食品安全应急检查对快速、低成本、可现场部署痕量Pb²⁺筛查的迫切需求。因此，开发能够实现超灵敏、选择性好且可现场检测Pb²⁺的高性能生物传感工具对铅污染防控具有重要意义。

脱氧核酶（DNAzyme）因其催化切割活性严格依赖特定金属辅因子，可提供优于适配体和抗体的靶标选择性，已成为重金属检测的理想识别元件。在已报道的Pb²⁺激活DNAzyme中，GR-5序列因其高催化效率、简便的序列设计和强抗干扰性能而被广泛用于Pb²⁺生物传感器构建。然而，大多数现有基于GR-5 DNAzyme的传感器依赖单层信号转导而无二级放大，灵敏度不足以检测复杂食品和环境水体中的皮摩尔级痕量Pb²⁺。CRISPR-Cas12a凭借可编程靶标识别和对周围单链DNA报告子的强非特异性反式切割活性，已彻底改变了分子生物传感领域，但Cas12a无法直接识别无机金属离子，需要核酸中间体将Pb²⁺识别事件转换为可检测的DNA切割事件。

已有研究将DNAzyme与核酸扩增或CRISPR模块整合以提升Pb²⁺检测灵敏度，但仍存在若干限制：大多数现有传感器仅提供单一类型读出，无法同时满足实验室准确定量和现场裸眼快速筛查的双重需求；繁琐的多步杂交和扩增流程延长了检测时间并产生较高背景信号；极少有生物传感器利用真实环境水样并结合金标准ICP-MS进行全面的验证。为克服上述缺陷，研究人员设计了一种将预组装线性支架固定在磁珠（magnetic bead，MB）上的传感架构，将Pb²⁺启动的DNAzyme切割与CRISPR-Cas12a级联放大相连接，建立了一种兼顾高分析灵敏度、简化操作和现场实用性的双读出生物传感器。

研究人员制备了磁珠支持的预组装GR-5 DNAzyme-线性支架复合物，实现一步式靶标转换。Pb²⁺触发特异性DNAzyme切割，释放多价线性支架产物，进而激活Cas12a的侧支切割活性并产生双光学读出。据此构建了两种信号输出模式：荧光通道用于实验室高精度定量分析，侧流层析（lateral flow strip，LFS）用于免仪器目视现场检测。研究人员系统优化了关键实验参数以提高信背比，并通过牛奶和自来水加标回收实验评估了动态范围、检测限、离子选择性和基质抗干扰能力。此外，以ICP-MS为标准参考方法对16个真实环境水样进行了平行定量，验证了该传感器的实际可靠性。该传感系统具有多项实用优势：预组装线性支架-磁珠组件简化了整体测试流程并通过磁分离降低背景信号；整合DNAzyme切割、多价支架介导的Cas12a激活和Cas12a反式切割的三重级联放大赋予平台出色的pM级检测灵敏度；双模式信号输出可同时满足高精度实验室测量和快速现场筛查需求。

### 1. 测量原理

研究人员将羧基化磁珠与Pb²⁺敏感的GR-5 DNAzyme及预组装的L1/L2支架链共价偶联，构建了集成式MB-GR-5S传感复合物。该一步预组装设计简化了整体测试流程，避免了现场分析所需的多步连续核酸杂交步骤。Pb²⁺引入后，固定的GR-5 DNAzyme启动金属依赖性催化切割，裂解其连接的GR-5S底物链，释放多价线性支架至上清液，通过磁分离即可收集。释放的线性支架含多个重复识别序列，可与crRNA-LbCas12a复合物杂交，进而激活LbCas12a对周围单链报告探针的强烈侧支反式切割活性。基于该级联反应系统实现两种独立信号输出模式：实验室定量分析中，FQ报告子被切割后荧光淬灭消除，恢复可检测荧光信号；便携式现场筛查中，FB报告子被激活的Cas12a降解，改变其在侧流层析条上的捕获行为，产生肉眼可辨的可见条带。通过GR-5 DNAzyme介导的底物切割、多价线性支架介导的Cas12a激活和LbCas12a侧支报告子切割这一系列连续信号转换过程，低浓度Pb²⁺输入被高效转换为强放大的光学信号，在同一平台内同时支持精确荧光定量和免设备目视识别。

### 2. 传感器表征与可行性验证

研究人员首先通过荧光流式细胞术验证了磁珠传感界面的成功构建。在固定颗粒计数模式下（每样本4000个有效颗粒事件），与未修饰空白磁珠相比，GR-5S-FAM功能化磁珠的FITC荧光峰出现明显右移，证实核酸链在磁珠表面的有效固定。天然聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）用于表征GR-5 DNAzyme的Pb²⁺依赖性切割性能：GR-5 DNAzyme与其GR-5S底物杂交产生滞留条带，表明DNAzyme-底物双链体稳定组装；加入Pb²⁺后杂交条带消失，同时出现迁移较快的切割片段条带，验证了GR-5 DNAzyme的靶标特异性催化切割能力。补充凝胶电泳结果进一步阐明了GR-5S、L1和L2之间的杂交相互作用。荧光测定最终验证了级联传感策略的整体可行性：仅在含Pb²⁺体系中检测到显著荧光增强，而所有对照组（突变GR-5、无crRNA、无Cas12a、无支架和空白）均维持低背景荧光。只有完整体系产生强信号，证实GR-5催化活性、crRNA、Cas12a和线性支架对级联放大均不可或缺。

### 3. 实验条件优化

预组装线性支架产生的荧光响应显著强于L1/L2双链体和对照组，研究人员将其归因于三个因素：多价结合效应（线性支架含多个重复crRNA识别序列，可同时激活多个Cas12a分子）；预组装架构提高了链可及性；预组装过程减少了不良分子内二级结构。随后通过单变量实验优化关键参数：EDC交联剂剂量优化表明，荧光信号随EDC剂量增加而逐渐增强并在20 mg时达到平台，选20 mg为最佳剂量；磁珠-核酸偶联时间从0.5 h增至2 h荧光强度显著增加，2 h后无显著改善，选2 h用于磁珠制备；缓冲液筛选中rCutSmart buffer产生最高荧光响应，因其离子强度、Mg²⁺浓度和pH同时支持GR-5 DNAzyme催化和LbCas12a反式切割；Pb²⁺激活DNAzyme切割时间优化显示，荧光从5 min至20 min持续增加并在20 min达到最大值，选20 min为最佳切割时间；5–40 °C温度范围评估显示37 °C时信号最大，被选为平衡DNAzyme切割和Cas12a活性的最佳温度；crRNA浓度从1增至100 nM过程中，信号在50 nM处达到平台并用于后续所有测定。核酸杂交模拟支持了链设计和线性支架组装及后续Cas12a激活的结构可行性。

### 4. 综合分析性能

在1 pM至100 nM的Pb²⁺浓度范围内，荧光响应以幂律模型拟合（y = 894.2·x^0.135，R² = 0.98），该区间被描述为动态范围而非线性范围。基于10个空白复样的3σ准则计算的荧光LOD为0.85 pM。在1、10和100 pM Pb²⁺浓度下三次重复测量的相对标准偏差（RSD）分别为7.8%、10.8%和11.9%，表明低浓度范围内荧光响应具有良好重复性。侧流层析结果中测试线颜色强度随Pb²⁺浓度降低而减弱，裸眼检测限为10 pM。T/C峰面积比从1 pM至100 nM呈幂律关系（y = 0.0215·x^0.244，R² = 0.99），计算LOD为3.92 pM。干扰实验显示，Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺和Cu²⁺在与Pb²⁺相同浓度时仅产生可忽略的荧光信号，而仅Pb²⁺诱导明显信号增强；含有100 nM Pb²⁺和10倍过量干扰离子（各1 μM）的混合物荧光响应与单独100 nM Pb²⁺相当，无明显信号衰减。对Cd²⁺、Hg²⁺、As、Ni²⁺、Co²⁺和Mn²⁺的单独测试也证实高特异性。基质效应研究表明，氯离子（0–20 mM）影响可忽略，腐殖酸（0–20 mg/L）和EDTA（0–20 μM）分别引起中等和强烈信号下降。五个独立制备批次的批间RSD为3.21%；侧流层析三个独立批次在1 nM和100 nM下平均T/C比分别为0.1212和0.2992，RSD分别为1.54%和1.69%。存储稳定性评估显示，在4 °C的1× PBS（pH 7.4）中，第5、10和15天保留信号分别为98.08%、87.03%和85.20%，第20、25和30天降至68.54%、64.25%和54.74%，表明短期现场应用足够但长期冷藏储存存在信号衰减。衰减可能源于DNA链降解、杂交支架部分解离和链可及性变化。荧光强度与侧流层析归一化T/C比呈强线性相关（y = 3506x + 936.8，R² = 0.98），支持两种读出模式的一致性。

### 5. 牛奶和自来水样品加标回收

在商业纯牛奶和实验室自来水两种基质中进行加标回收实验。牛奶经乙腈沉淀蛋白预处理，自来水经0.22 μm滤膜过滤。Pb²⁺加标浓度分别为0.1、1、10和100 nM。牛奶回收率为97.0%–107.5%，自来水回收率为99.4%–105.3%，相对标准偏差均低于5%。这些结果证明该方法在代表性食品相关和水样基质中具有满意的分析准确度、重现性和抗基质干扰能力。与已报道的Pb²⁺检测方法比较，该平台在灵敏度和工作范围方面具有竞争力。

### 6. 环境水样分析与方法对比

为系统验证传感器在真实样品检测中的实用性，研究人员从湖南长沙某当地水处理厂采集了16个环境水样，使用所建双模式平台和作为参考技术的ICP-MS进行平行定量。16个样品中Pb²⁺浓度范围为0.09至0.45 nM。ICP-MS校准曲线在0.02–10 μg/L范围内呈现良好线性（y = 0.02992x + 0.001927，R² = 0.9997），采用铋（Bi）作为内标校正基质效应，内标回收率为71.5%–97.4%，检测限为0.003 μg/L。对比结果显示，传感器检测的Pb²⁺浓度分布与ICP-MS数据集匹配良好。Bland-Altman统计分析显示两种方法间平均偏差为0.0067 nM，95%一致性界限为?0.0255至0.0389 nM，几乎所有样本点均落在此范围内。线性相关绘图进一步确认了强定量一致性，决定系数R² = 0.971。此外，对加标0、0.1、1、10和100 nM Pb²⁺的五个自来水样本进行了荧光通道和LFA试纸条平行分析，结果显示随着加标浓度增加，LFA T/C比和目视判读等级均增加，与荧光定量趋势一致；未加标样本呈阴性目视结果，而所有加标样本均产生不同强度的阳性响应。

### 7. 讨论与结论总结

讨论部分指出，侧流层析读出在实际现场应用中仍面临挑战：肉眼判读测试线具有固有的主观性，目视检测限可能因操作者、环境光照和个人颜色感知而异，特别是在接近目视阈值的低Pb²⁺浓度下易引入读数偏差；Cas12a侧支切割活性依赖温度，需要稳定的热环境，现场环境温度波动可能降低信号重现性和检测灵敏度；侧流层析条批次间差异（抗体固定、金纳米颗粒偶联和膜性能差异）可影响T/C比和目视判读等级。为应对这些局限，可考虑智能手机辅助图像采集与定制图像处理算法提供客观的定量T/C比分析，减少主观判读误差；冻干酶-试剂整合（将Cas12a、crRNA和报告子预分装并冻干在试纸条或反应腔室中）可简化操作、延长保质期并提高对环境温度波动的耐受性；每条试纸条采用严格质量控制并使用内标或校准物有助于校正批次间差异。通过这些改进，所提出的双模式平台有望在现场Pb²⁺筛查中更加稳健和用户友好。

研究结论部分翻译如下：在这项研究中，研究人员通过将Pb²⁺特异性DNAzyme切割与预组装线性支架和CRISPR-Cas12a级联信号放大相结合，构建了一种用于痕量Pb²⁺定量的双模式生物传感平台。预组装线性支架作为中间信号转换器，简化了整体反应流程，并将痕量铅信号高效转换为可放大的Cas12a激活核酸底物。依托这种模块化设计，该平台支持两种不同的检测输出：高精度荧光测量和低成本的裸眼侧流层析试纸条筛查。得益于多级信号放大策略，该系统实现了Pb²⁺的超痕量检测，并对常见共存金属离子表现出强抗干扰能力。在加标牛奶和自来水中获得了满意的定量性能，对真实水样的平行分析产生了与标准ICP-MS检测高度一致的结果。总体而言，这项工作为铅污染监测提供了一条简捷的分析途径，并展示了将DNAzyme识别与CRISPR级联放大相结合用于重金属分析的潜力。