基于还原氧化石墨烯-纳米多孔金修饰微电极的电化学传感器用于抗坏血酸、多巴胺和尿酸的同时检测

《Sensing and Bio-Sensing Research》：Electrochemical sensor based on reduced graphene oxide-nanoporous gold-modified microelectrode for simultaneous detection of ascorbic acid, dopamine, and uric acid

　　

摘要专业翻译 基于还原氧化石墨烯-纳米多孔金修饰微电极（rGO-NPG/Au-μE）的电化学传感器被开发用于抗坏血酸（ascorbic acid，AA）、多巴胺（dopamine，DA）和尿酸（uric acid，UA）的同时检测。该复合材料的协同效应显著增强了电子转移动力学和催化活性。在差分脉冲伏安法（differential pulse voltammetry，DPV）下，三种分析物的氧化峰得到了清晰分离，实现了三组分的同时测定。该传感器表现出较低的检测限：AA为17.8 μmol·L?1，DA为0.65 μmol·L?1，UA为0.37 μmol·L?1。在实际尿液样本中，该传感器展示了高选择性和准确的检测性能。

论文解读

一、研究背景与意义

抗坏血酸（AA）、多巴胺（DA）和尿酸（UA）是共存于生物基质中的小分子生物标志物，在多种生理和代谢过程中发挥重要作用。AA作为关键抗氧化剂可中和自由基以保护细胞免受氧化损伤并支持免疫防御，其摄入不足可导致疲劳、肌肉无力、伤口愈合延迟及牙龈肿胀出血等症状，而摄入过量则可能引起呕吐、腹泻、恶心和上腹不适。DA作为重要神经递质，其分泌不足与应激、抑郁、帕金森病、精神分裂症、阿尔茨海默病和亨廷顿病等神经疾病密切相关。UA是嘌呤代谢的产物，作为重要的临床生物标志物与高尿酸血症、痛风和肾功能障碍相关联。因此，开发灵敏且选择性的传感平台对于可靠的临床诊断和即时检测（point-of-care，POC）应用至关重要。

目前已有多种方法用于检测这些生物分子，包括高效液相色谱-电化学检测（HPLC-ECD）、超高效液相色谱-飞行时间质谱联用（LC-MS-TOF）、分光光度法和荧光法等。然而这些方法存在成本高、样品前处理繁琐、耗时长以及需要专业人员操作等不足。电化学传感因其高灵敏度、快速响应、低成本和易于小型化等固有优势而成为检测此类分析物的有力方法。然而，在裸常规电极上同时测定AA、DA和UA仍面临重大挑战：三种物质的氧化电位接近导致伏安峰严重重叠；AA在生物体液中的浓度通常显著高于DA和UA，其主导电流会掩盖后两者的响应；此外，常规电极存在电子转移动力学缓慢、活性表面积有限以及氧化产物不可逆吸附导致电极污染等问题。

为克服上述局限，研究者采用功能纳米材料修饰电极表面以增强电子转移动力学、增大电活性面积并改善对AA、DA和UA响应的分辨能力。然而，单一组分修饰材料可能无法同时提供高导电性、电催化活性、大表面积、化学稳定性和抗污染性能。因此，整合不同组分互补特性的杂化纳米材料成为有前景的策略。其中，纳米多孔金（nanoporous gold，NPG）因其独特的三维多孔结构、高比表面积、优异的导电性和内在电催化活性而备受关注。动态氢气泡模板（dynamic hydrogen bubble template，DHBT）电沉积法因其快速、经济且能有效制备清洁多孔结构而受到青睐。但NPG单独使用时往往难以充分分辨结构相似或共存生物分析物之间紧密排列的氧化电位。将还原氧化石墨烯（reduced graphene oxide，rGO）整合进来可增强AA、DA和UA的选择性和电化学传感性能。rGO丰富的π共轭域可促进快速电子转移，并通过吸附和静电相互作用增强与目标分析物的强相互作用。因此，rGO-NPG杂化平台可提供NPG的高表面积和催化活性与rGO优异导电性和吸附能力的协同组合。

二、研究内容与主要结论

研究人员开发了一种基于rGO-NPG杂化修饰的金微电极（rGO-NPG/Au-μE）高性能电化学微传感器，用于AA、DA和UA的选择性和同时检测。该传感器在检测限、线性响应范围和选择性等分析特性方面得到系统评估。通过标准加入法在合成尿液样本中成功验证了该传感器的实际应用价值。该工作凸显了rGO-NPG微电极作为临床诊断和微型化即时检测分析平台的稳健性。

三、关键技术方法

研究人员采用了以下主要关键技术方法：其一，金微电极（Au-μE）的制备——使用高纯度金丝（?=25 μm，99.99%）装入200 μL微量移液器吸头，以导电银胶连接镍铬引线，环氧树脂密封固化，碳黑填充内腔，经逐级砂纸机械抛光暴露光滑金微盘，并在0.50 mol·L^?1 H₂SO₄中进行循环伏安电化学清洗。其二，NPG的电沉积——采用DHBT法，在含5.00 mmol·L^?1 HAuCl₄和0.50 mol·L^?1 H₂SO₄的溶液中，于1500 rpm剧烈搅拌下施加?4.00 V恒定电位60 s，形成高度多孔的三维金属框架。其三，rGO的电化学共沉积/还原——将新鲜制备的NPG/Au-μE浸入0.500 mg·mL^?1 GO分散液中，在?1.20 V静置条件下电化学沉积60 s，GO被还原为rGO并锚定在多孔NPG内部及表面。其四，电化学表征与检测——采用循环伏安法（CV）、差分脉冲伏安法（DPV）和电化学阻抗谱（EIS）对修饰电极进行表征和检测，场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）结合能量色散X射线光谱（EDS）用于表面形貌和元素分析。合成尿液样本按文献方法制备，含尿素、肌酐、NaCl、KCl、MgSO₄·7H₂O、CaCl₂·7H₂O和NaH₂PO₄，pH调至6.0。

四、研究结果

NPG和rGO-NPG/Au-μE的电化学与形貌表征。 FE-SEM图像显示，NPG/Au-μE呈现高度多孔的三维金属框架，由随机互连的金韧带和开放的纳米孔洞组成，提供大面积电化学活性表面和高密度可及催化位点。rGO-NPG/Au-μE表面呈现粗糙的褶皱片状rGO结构包裹并锚定在金韧带和多孔通道上，但rGO片并未堵塞NPG框架的底层多孔结构，而是形成开放的三维多孔杂化复合网络。EDS分析确认了Au和C元素的共存，rGO-NPG中氧含量降低和C/O比增加与GO还原过程中含氧官能团的去除一致。

修饰微电极的电化学表征。 在5.00 mmol·L^?1 [Fe(CN)₆]^3?溶液中，裸Au-μE呈现典型的稳态径向传质S形伏安图。NPG/Au-μE显示准可逆电化学响应，峰峰分离（ΔEp）为119 mV，阳极和阴极峰电流分别为74.2 nA和?53.6 nA，异相电子转移速率常数（k°）为3.57×10^?3 cm·s^?1。rGO-NPG/Au-μE的ΔEp降至93 mV，峰电流增至95.2 nA和?67.2 nA，k°提高至7.19×10^?3 cm·s^?1，表明高表面积3D NPG与高导电rGO片的协同组合显著促进了界面电荷转移动力学。EIS显示电荷转移电阻（Rct）从裸电极的89.42 MΩ降至NPG/Au-μE的2.33 MΩ和rGO-NPG/Au-μE的2.80 MΩ。

AA、DA和UA在裸电极和修饰电极上的电化学特性。 在裸Au-μE上未观察到AA、DA和UA的明显氧化信号，归因于高背景电流和缓慢的电子转移动力学。rGO-NPG/Au-μE则呈现三个清晰定义的氧化峰，AA–DA和DA–UA的峰峰分离分别为176 mV和150 mV，足以实现无信号重叠的明确单独定量。

溶液pH和扫描速率的影响。 pH在3.00–6.00范围内，AA和UA的峰电流随pH升高而逐渐降低，DA的氧化电流在pH 4.00时达到最大值后下降，故选择pH 4.00为最优条件。AA、DA和UA的Epa-pH线性回归方程斜率分别为?0.0580、?0.0561和?0.0590 V/pH，接近理论Nernst斜率?59.1 mV/pH，表明各分析物的氧化机制涉及等量质子和电子转移（2e^?/2H⁺过程）。扫描速率研究表明，AA在低扫描速率下斜率为0.30（受限于3D纳米多孔金通道内的受限扩散），高扫描速率下斜率升至0.77（混合扩散-吸附机制）；UA斜率0.895表明混合扩散-吸附控制过程；DA斜率1.05接近1，表明以吸附控制为主，归因于带正电荷的多巴胺与rGO片上带负电荷的含氧官能团之间的强π-π堆积和静电吸引作用。

AA、DA和UA的同时测定。 在优化条件下，AA在20.0–3000 μmol·L^?1范围内呈线性响应，线性方程为I_P (nA) = 0.0537C (μmol·L^?1) + 43.2（R² = 0.998）。DA呈现两个线性区间：1.00–10.0 μmol·L^?1（灵敏度2.39 nA/(μmol·L^?1)）和10.0–150 μmol·L^?1（灵敏度0.602 nA/(μmol·L^?1)）。UA在1.00–150 μmol·L^?1范围内线性方程为I_P (nA) = 0.627C (μmol·L^?1) ? 0.737（R² = 0.997）。检测限（LOD，3σ/s标准）分别为AA 17.8 μmol·L^?1、DA 0.650 μmol·L^?1和UA 0.370 μmol·L^?1。与文献报道的多种修饰电极相比，该传感器具有竞争力的分析性能，且制备过程快速、简便、经济，仅需120 min。

选择性和实际样品分析。 在含1000 μmol·L^?1 AA、50.0 μmol·L^?1 DA和100 μmol·L^?1 UA的溶液中引入5.00 mmol·L^?1尿素、100 mmol·L^?1 NaCl和2.00 mmol·L^?1葡萄糖后，三种分析物的峰电流和峰电位变化均≤10%，证实了良好的选择性。对乙酰氨基酚作为电活性干扰物对UA氧化响应产生明显影响，但对AA和DA信号影响较小，这是该传感器在复杂生物基质中测量时需考虑的局限性。在100倍稀释的合成尿液样本中采用标准加入法进行回收率研究，平均回收率范围为92.2%–114.6%，RSD < 7.90%（n = 3），确认了良好的分析准确性和重复性。

五、讨论与结论

该研究报道了基于rGO-NPG的高性能电化学微传感器的制备，用于AA、DA和UA的选择性和同时检测。rGO-NPG/Au-μE传感器展现出优异的分析性能，具有高灵敏度、宽线性动态范围和低检测限。增强的传感能力源于纳米多孔金三维高表面积框架与导电rGO网络提供的快速电荷转移动力学之间的协同作用。该杂化结构有效解决了三种共存生物分子间的信号重叠问题，同时保持高灵敏度。此外，该传感器对常见生理干扰物表现出稳健的选择性，并在合成尿液样本中展示了实际分析应用价值，获得了满意的回收率和高重复性。25 μm金微盘基底通过汇聚径向传质、低电容背景电流和微升级样品量需求，提供了高信噪比性能，使rGO-NPG/Au-μE平台成为集成到便携式、低成本、微型化即时检测系统中的极具前景的候选方案。该平台的制备流程快速、简便且经济高效，完全在台式条件下运行，无需复杂光刻工具或有毒化学粘合剂，结合低材料消耗和稳健的操作稳定性，凸显了该微传感器架构用于大规模生产和无缝集成到便携式分散即时检测平台的可扩展性。未来研究将聚焦于评估rGO-NPG/Au-μE界面的长期储存稳定性，并直接在未稀释的原始临床生物体液中验证其分析性能，以确立其在分散式诊断应用中的实际可行性。