高通量发现靶向肌动蛋白的结合化合物用于心脏疾病治疗

《SLAS Discovery》：High-throughput discovery of actin-binding compounds for cardiac disorders

　　

心肌病（CM）是一组复杂且表型多样的心脏疾病，与心力衰竭（HF）、心律失常和心源性猝死等显著不良结局相关。肥厚型心肌病（HCM）被认为是心肌病中最常见的亚型，在成年人群中估计患病率为1:500至1:200，约60%的病例携带肌节基因突变。HCM的特征是左心室壁异常肥厚、心脏过度收缩、舒张功能受损和纤维化。扩张型心肌病（DCM）是心脏移植的主要原因，其特征是心脏收缩功能减退和心室腔扩大，导致进行性心力衰竭。DCM可由遗传和环境因素共同引起；高达50%的病例为家族性，由于许多DCM相关突变的不完全外显率，这一比例可能被低估。家族性心肌病通常涉及编码心肌细胞力产生相关蛋白的基因的错义突变或单倍剂量不足。 骨骼肌和心肌中的力产生主要源于肌球蛋白与肌动蛋白之间的相互作用。这种力产生的基础是肌球蛋白的肌动蛋白激活ATP酶活性，其根据肌球蛋白的核苷酸结合状态，在弱亲和力与强亲和力状态之间循环转换。当与ATP结合或ATP水解后但无机磷酸盐（Pi）解离之前，肌球蛋白对肌动蛋白具有弱亲和力（W状态）。Pi从肌球蛋白活性位点解离导致向强结合（S，类 rigor）状态的转变。W与S状态之间的转变引起肌球蛋白和肌动蛋白的结构变化，导致肌肉收缩。这一过程受肌动蛋白结合的肌钙蛋白复合物（Tn）和原肌球蛋白（Tm）调控，它们对细胞内钙离子（Ca2+）浓度敏感。肌球蛋白与肌动蛋白的强结合是肌动球蛋白横桥循环的额外协同激活因子。肌球蛋白头部可被隔离在超松弛（SRX）状态，阻止头部与肌动蛋白相互作用。目前研究表明，SRX状态下肌球蛋白头部的比例受肌球蛋白调节轻链（RLC）磷酸化以及肌球蛋白与肌球蛋白结合蛋白C（MyBPC）之间相互作用的影响。 肌肉功能可通过肌节蛋白的基因突变或翻译后修饰而改变。虽然至少有20个基因的突变与HCM的发生有关，但编码β-肌球蛋白重链的基因突变最为普遍，占已记录病例的15-25%。MyBPC、肌动蛋白、Tm和Tn中的多个突变也可导致HCM/DCM。HCM患者中观察到的心脏过度收缩的一个可能机制是心肌肌球蛋白工作循环比的增加，该比值定义为处于肌动蛋白结合S状态的肌球蛋白头部比例。一些HCM突变释放SRX状态下的头部，允许形成更多横桥。DCM相关的β-心肌肌球蛋白突变被发现降低了肌球蛋白的工作循环比和力维持能力。由于肌动蛋白-肌球蛋白相互作用功能异常在HCM等肌肉疾病中的重要性，开发肌动蛋白-肌球蛋白相互作用的小分子调节剂一直是开发HCM和其他肌病治疗方法的重要目标。 目前CM的一线治疗通常包括β受体阻滞剂、血管紧张素转换酶抑制剂（ACE-I）或血管紧张素受体-脑啡肽酶抑制剂（ARNI）、盐皮质激素受体拮抗剂（MRA）、钠-葡萄糖共转运蛋白2（SGLT2）抑制剂和利尿剂的组合。尽管这些治疗近年来显著降低了发病率和死亡率，但它们并不直接靶向驱动这些疾病的心肌功能障碍，且往往无法充分控制疾病进展。心肌病极为多样的遗传原因和临床表现要求针对不同类型的心肌细胞功能障碍开发靶向治疗。因此，靶向肌节蛋白相互作用的小分子调节剂作为DCM和HCM的疗法具有极大的治疗意义。迄今为止，只有两种心肌肌球蛋白抑制剂（mavacamten和aficamten）被批准用于治疗梗阻性HCM，且mavacamten在非梗阻性HCM中疗效有限，仅适用于部分患者。这些药物的批准表明肌节蛋白可直接作为潜在心力衰竭疗法的靶点。治疗CM复杂多样性的未满足需求要求多种机制上不同的调节剂，以提供广泛有效的治疗选择。这些新药需要靶向肌动球蛋白循环的特定步骤，以及由细胞内钙调控的肌肉调节。此前开发的肌节调节剂未聚焦于靶向心肌肌动蛋白，因为它高度保守且与心肌肌节内的多种其他蛋白相互作用。这为肌动球蛋白调节留下了一个未开发的潜在途径。尽管肌动蛋白亚型之间的序列同一性很高，但此前已证明肌动蛋白亚型具有不同的功能，且往往不能相互替代。骨骼肌和心肌肌动蛋白亚型在力产生和肌动球蛋白横桥形成方面存在显著差异。肌肉肌动蛋白亚型在肌原纤维力产生效应上的这些细微但显著的差异表明，肌动蛋白可能是开发肌动球蛋白调节剂的潜在靶点。 研究人员此前开发了一种用于发现新型肌动球蛋白调节剂的高通量筛选（HTS）测定法。利用时间分辨FRET生物传感器，荧光素马来酰亚胺（F-MAL）标记的肌动蛋白（供体）和连接到12氨基酸ELCA1肽（ANT）上的dabcyl（受体），研究人员此前检测到几种改变肌动球蛋白结构和功能的肌动蛋白结合化合物。该工作确立了检测肌动蛋白结合小分子作为肌动球蛋白活性特异性调节剂的可行性，以及从更大规模小分子库筛选中识别这些化合物的流程。 在当前研究中，研究人员筛选了FDA批准的化合物库（SELLECK），目标是识别对心肌具有特异性的肌动蛋白结合化合物。此前的研究受限于国家临床收藏（NCC）库（727种化合物）的规模较小。虽然NCC库包含已在临床试验中测试的化合物，但并非所有化合物都获得FDA批准，有些可能具有不利的安全性、生物利用度或药代动力学特征。SELLECK库包含2684种具有已知安全性特征的FDA批准化合物，克服了药物发现中的一个重大问题。本研究直接建立在先前工作的基础上；当前研究的主要目标是通过实施小型化的1536孔测定法，大幅扩展用于肌动蛋白-肌球蛋白相互作用调节剂筛选的化学空间。相对于384孔板筛选，这一转变将资源需求减少了10倍，并将数据采集速率提高了4倍。此外，这项工作旨在为下一步奠定基础——将1536孔HTS平台应用于规模更大的分子集合（>50,000种化合物）。当前研究既提供了筛选通量的显著增加，也提供了识别具有先前未被识别的肌动蛋白-肌球蛋白相互作用效应的药理学表征化合物的扩展机会。从当前SELLECK库筛选中识别出的心脏特异性化合物可作为药物化学的起点进行研究，目标是提高心肌特异性或药物效力。

一、研究背景与科学问题

心肌病（CM）是一组复杂且表型多样的心脏疾病，与心力衰竭（HF）、心律失常和心源性猝死等显著不良结局相关。肥厚型心肌病（HCM）是最常见的亚型，成人患病率约1:500至1:200，约60%的病例携带肌节基因突变，表现为左心室壁异常肥厚、心脏过度收缩、舒张功能受损和纤维化。扩张型心肌病（DCM）是心脏移植的主要原因，以心脏收缩功能减退和心室腔扩大为特征，可导致进行性心力衰竭，家族性病例高达50%。

骨骼肌和心肌的力产生主要源于肌球蛋白与肌动蛋白的相互作用，其基础是肌球蛋白的肌动蛋白激活ATP酶活性。肌球蛋白根据核苷酸结合状态在弱亲和力（W状态）与强结合（S状态）之间循环转换，该过程受肌钙蛋白复合物（Tn）和原肌球蛋白（Tm）调控，对细胞内钙离子（Ca²⁺）浓度敏感。HCM的过度收缩机制被认为是心肌肌球蛋白工作循环比增加，而DCM相关突变则降低工作循环比和力维持能力。

目前CM的一线治疗（β受体阻滞剂、ACE-I/ARNI、MRA、SGLT2抑制剂和利尿剂）虽降低了发病率和死亡率，但不直接靶向驱动疾病的心肌功能障碍，常无法充分控制疾病进展。目前仅两种心肌肌球蛋白抑制剂（mavacamten和aficamten）获批用于梗阻性HCM，且mavacamten在非梗阻性HCM中疗效有限。治疗CM复杂多样性的未满足需求要求多种机制上不同的调节剂。此前开发的肌节调节剂未聚焦于靶向心肌肌动蛋白，尽管肌动蛋白亚型间存在显著功能差异，这为肌动球蛋白调节留下了未开发的途径。本研究旨在通过高通量筛选FDA批准的SELLECK化合物库（2684种化合物），识别对心肌具有特异性的肌动蛋白结合化合物，并建立1536孔筛选平台以大幅扩展化学空间。

二、研究内容与结论

研究人员建立了基于时间分辨FRET（TR-FRET）的高通量筛选平台，利用荧光素马来酰亚胺（F-MAL）标记的肌动蛋白（供体）和dabcyl标记的12氨基酸ELCA1肽（ANT）（受体），在1536孔板中筛选了2684种FDA批准化合物，最终浓度10 μM。相对于384孔板，资源需求减少10倍，数据采集速率提高4倍。通过FRET浓度-反应（CRC）测定确认命中化合物，并在骨骼肌和心肌肌原纤维中评估其对ATPase活性和Ca²⁺敏感性的影响。

三、主要技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：1）时间分辨FRET（TR-FRET）高通量筛选平台，利用F-MAL标记肌动蛋白与dabcyl标记ANT肽的FRET对检测化合物对肌动蛋白构象的影响；2）荧光寿命板读取器（FLTPR）实现高通量高精度荧光寿命检测；3）1536孔板小型化筛选体系，通过Echo 550声学液体分配器实现纳升级化合物分配；4）FRET浓度-反应（CRC）测定验证命中化合物；5）酶偶联NADH-linked ATPase测定评估骨骼肌（兔腰大肌）和心肌（牛左心室）肌原纤维的ATPase活性；6）Hill方程拟合分析浓度依赖性和Ca²⁺敏感性。

四、研究结果

4.1 高通量筛选平台建立与验证：研究人员将2684种SELLECK化合物从96孔板重新格式化为1536孔板，通过Echo 550声学分配器每孔分配5 nL化合物溶液（DMSO中），最终浓度10 μM。利用FLTPR记录荧光寿命数据，通过单指数衰减函数拟合波形，计算FRET效率（E = 1 – τ_DA/τ_D）。以Z?因子≥0.5作为优良测定质量指标，化合物改变τ_DA超过对照（0.1% DMSO）4倍标准差（>4SD）即视为命中。

4.2 命中化合物确认与浓度-反应分析：命中化合物从TargetMol购买并溶于DMSO制备10 mM储备液，在384孔板中进行八个浓度（0.5–100 μM）的TR-FRET浓度-反应测定。使用Hill方程拟合浓度依赖性TR-FRET变化，确定EC₅₀值。

4.3 骨骼肌与心肌肌原纤维ATPase活性评估：研究人员制备了兔腰大肌骨骼肌原纤维和牛左心室心肌肌原纤维，在激活pCa 4.0和松弛pCa 8.0条件下，以50 μM化合物浓度评估其对ATPase活性的影响。骨骼肌和心肌的缓冲液成分略有不同（骨骼肌：50 mM MOPS、100 mM KCl、5 mM MgCl₂、1 mM EGTA，pH 7.0；心肌：20 mM MOPS、35 mM NaCl、5 mM MgCl₂、1 mM EGTA，pH 7.0），以确保最佳酶活性。通过NADH氧化速率（340 nm吸光度下降）测定稳态ATPase速率，数据以μmol ATP/mg protein/min表示。

4.4 Ca²⁺敏感性调节：通过EGTA缓冲控制游离Ca²⁺浓度，使用Hill方程拟合pCa-ATPase关系曲线，评估化合物对心肌肌原纤维Ca²⁺敏感性的影响，识别机制上不同的调节剂。

五、讨论与结论

本研究成功建立了1536孔TR-FRET高通量筛选平台，显著提高了筛选通量并降低了资源消耗。通过筛选FDA批准的SELLECK库，研究人员识别出多种机制上不同的肌动蛋白结合化合物，这些化合物能够调节心肌肌原纤维的Ca²⁺敏感性。这些心脏特异性化合物可作为药物化学优化的起点，以提高心肌特异性或药物效力。该研究为将1536孔HTS平台应用于更大规模化合物库（>50,000种化合物）奠定了基础，为开发针对心肌病复杂多样性的多种机制上不同的调节剂提供了新途径，填补了靶向心肌肌动蛋白这一未开发领域的空白。