《Oncogene》：Stabilization of LTBP2 by SIRT1 promotes EMT and chemosensitivity in cardia gastric adenocarcinoma through TGF-β signaling
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贲门胃腺癌（CGA）是一种侵袭性强、发病率上升且预后差的恶性肿瘤，其发生部分由显著的分子异质性驱动。通过整合生物信息学与临床分析，研究人员鉴定出潜在转化生长因子β结合蛋白2（LTBP2）是一种关键异质性表达蛋白，其在CGA中较非贲门胃腺癌（NCGA）显著上调，
贲门胃腺癌（CGA）是一种侵袭性强、发病率上升且预后差的恶性肿瘤，其发生部分由显著的分子异质性驱动。通过整合生物信息学与临床分析，研究人员鉴定出潜在转化生长因子β结合蛋白2（LTBP2）是一种关键异质性表达蛋白，其在CGA中较非贲门胃腺癌（NCGA）显著上调，并与晚期肿瘤分期和生存期缩短相关。机制上，研究人员揭示了一种新的LTBP2翻译后调控：SIRT1（sirtuin 1）介导的去乙酰化通过减弱LTBP2与CUL3（cullin-3）/SPOP（speckle-type POZ protein）E3泛素连接酶复合物的结合来稳定LTBP2，从而减少泛素化和蛋白酶体降解。功能上，稳定化的LTBP2激活转化生长因子β（TGF-β）/磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（AKT）信号轴，在体外和体内促进肿瘤细胞增殖、上皮-间质转化（EMT）和转移。LTBP2或SIRT1的基因敲除削弱肿瘤生长和EMT，而这些表型可被LTBP2重建所挽救。重要的是，LTBP2缺失使肿瘤对5-氟尿嘧啶（5-FU）化疗敏感，这在细胞模型和鼠异种移植瘤中均得到验证。总之，研究人员的发现阐明了一个对CGA进展和化疗耐药至关重要的SIRT1-LTBP2-TGF-β调控轴，并提名LTBP2作为该侵袭性胃癌亚型的有前景治疗靶点。
研究背景方面，胃腺癌（GA）是常见恶性肿瘤，其中贲门胃腺癌（CGA，cardia gastric adenocarcinoma）发病率上升，而非贲门胃腺癌（NCGA，non-cardia gastric adenocarcinoma）呈下降趋势；CGA诊断时分期更晚、临床病理特征更差，可能与显著肿瘤异质性有关。肿瘤异质性涉及肿瘤细胞遗传和表观遗传景观差异，是治疗反应等不同临床行为的重要驱动，因此识别CGA等侵袭性亚型的异质性调控因子是改善管理的关键。翻译后修饰（PTMs，post-translational modifications）可动态重塑致癌通路并影响蛋白稳定性、活性和相互作用，其中乙酰化和泛素化在癌症进展中调控关键信号蛋白。研究人员据此鉴定LTBP2（latent transforming growth factor beta-binding protein 2，潜在转化生长因子β结合蛋白2）在CGA与NCGA间存在明显表达异质性，并阐明SIRT1（sirtuin 1）介导去乙酰化通过减弱CUL3/SPOP E3泛素连接酶复合物依赖的泛素化降解而稳定LTBP2；LTBP2通过激活TGF-β（transforming growth factor-β，转化生长因子β）/PI3K-AKT（磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B）通路促进肿瘤增殖和上皮-间质转化（EMT，epithelial-mesenchymal transition）。体内LTBP2缺失抑制肿瘤生长和转移能力并增强5-氟尿嘧啶（5-FU）敏感性。该研究揭示CGA中LTBP2异质性的PTM依赖机制，并将LTBP2提名为有前景的治疗靶点。
关键技术方法方面，研究人员整合TCGA、cBioPortal、GEO:GSE29272及GEPIA等数据库进行生物信息学分析；采用56例CGA和31例NCGA组织芯片（NCGA组织来自同济医院，芯片由上海芯超公司制作）及9例CGA、7例NCGA新鲜肿瘤组织进行免疫组织化学（IHC）和酶联免疫吸附试验（ELISA）；在AGS、HEK-293T和MFC细胞中开展RNA干扰、CRISPR-Cas9敲除、免疫共沉淀（Co-IP）、Western blot、qRT-PCR、EdU、CCK-8、划痕和Transwell实验；并建立BALB/c裸鼠皮下成瘤、脾注射肝转移及5-FU治疗模型。
研究结果如下。第一，CGA与NCGA中LTBP2的差异表达：研究人员通过TCGA数据库分析获得127个在肿瘤中高表达且与不良预后相关的基因，结合GEO:GSE29272发现DACT1、NREP和LTBP2存在显著表达差异；cBioPortal分析显示仅LTBP2在不同解剖部位呈差异表达，贲门最高、胃体次之、胃窦最低，CGA高于NCGA；ELISA显示CGA组织LTBP2蛋白显著高于NCGA；56例CGA和31例NCGA组织芯片IHC显示LTBP2在总体GA、CGA和NCGA中高表达，CGA中高LTBP2与较差总生存相关，总体GA和CGA中III/IV期LTBP2高于I/II期，NCGA无显著相关，且CGA中LTBP2显著高于NCGA。第二，LTBP2经泛素-蛋白酶体途径降解：蛋白酶体和溶酶体抑制剂处理中仅MG132增加LTBP2蛋白丰度并延长半衰期；Cullin类E3连接酶抑制剂NAE-IN-M22增加LTBP2；过表达Cullin-3降低LTBP2，Co-IP证实LTBP2与CUL3相互作用，CUL3过表达增加内源和外源LTBP2泛素化；SPOP过表达降低LTBP2并与LTBP2相互作用，siRNA敲低SPOP增加LTBP2，SPOP过表达增加而敲低减少LTBP2泛素化；SPOP MATH结构域突变体R45W和D77Y不降低LTBP2且减弱其泛素化，表明CRL3-SPOP E3连接酶复合物介导LTBP2泛素化和降解。第三，SIRT1去乙酰化并通过减少CUL3-LTBP2相互作用稳定LTBP2：去乙酰化酶抑制剂NAM而非TSA显著降低LTBP2蛋白并缩短半衰期，NAM增加LTBP2乙酰化和泛素化；过表达SIRT1增加LTBP2蛋白，敲低SIRT1降低LTBP2蛋白而不影响mRNA，SIRT1过表达延长LTBP2半衰期并与LTBP2相互作用；SIRT1过表达降低LTBP2乙酰化和泛素化，敲低SIRT1降低二者；SIRT1过表达减少LTBP2与CUL3结合，NAM增强该结合。第四，LTBP2和SIRT1影响体内外肿瘤增殖、迁移、侵袭和EMT：CRISPR-Cas9敲除LTBP2或SIRT1抑制AGS细胞EdU增殖，SIRT1敲除细胞中过表达LTBP2可挽救增殖；GO和GSEA提示LTBP2与细胞黏附、细胞外基质及EMT通路相关；划痕和Transwell显示敲除LTBP2或SIRT1削弱迁移侵袭，SIRT1敲除细胞过表达LTBP2恢复迁移；LTBP2敲除增加E-cadherin并降低N-cadherin和Vimentin，SIRT1敲除细胞过表达LTBP2降低E-cadherin并增加N-cadherin和Vimentin；LTBP2敲除降低FN、COL1和α-SMA；MFC皮下成瘤中敲除LTBP2或SIRT1减小肿瘤大小和重量，IHC显示Ki-67降低、E-cadherin降低、N-cadherin增加；脾注射肝转移模型中敲除LTBP2或SIRT1减少肝转移结节，SIRT1敲除细胞过表达LTBP2恢复转移能力。第五，LTBP2通过TGF-β/PI3K-AKT轴影响肿瘤EMT：GEPIA显示胃癌中LTBP2与TGF-β表达正相关；AGS细胞敲除LTBP2降低TGF-β mRNA、蛋白及培养上清TGF-β浓度；KEGG富集显示PI3K/AKT通路与LTBP2最相关，LTBP2敲除降低PI3K和AKT磷酸化；外源补充TGF-β恢复LTBP2敲除细胞的PI3K和AKT磷酸化，降低E-cadherin并增加N-cadherin和Vimentin，增强迁移；SIRT1敲除细胞过表达LTBP2恢复PI3K/AKT通路活性。第六，LTBP2通过激活TGF-β信号促进EMT并调节化疗敏感性：AGS和MFC中sgLTBP2联合5-FU较单用sgLTBP2或5-FU显著降低细胞活力；皮下MFC模型中5-FU和LTBP2敲除均抑制肿瘤生长，联合组肿瘤大小和体积下降更明显；IHC显示联合组Ki-67更低；肿瘤组织IB显示LTBP2敲除组N-cadherin、vimentin及磷酸化PI3K和AKT降低，提示LTBP2敲除通过调控PI3K/AKT通路影响EMT而增强5-FU敏感性。第七，SIRT1与LTBP2在肿瘤样本中正相关：87例胃癌组织芯片IHC显示SIRT1在肿瘤组织较癌旁非癌组织低；总体GC及CGA中III/IV期SIRT1高于I/II期，NCGA中无显著相关；CGA中高SIRT1与不良预后相关；总体GC、CGA和NCGA中SIRT1与LTBP2表达正相关；CGA中SIRT1显著高于NCGA。
讨论部分总结：CGA按Siewert分类为肿瘤中心位于食管胃结合部（EGJ）上方1 cm至下方2 cm并侵犯EGJ的肿瘤类型；NCGA发病率逐年下降而CGA上升，CGA预后较NCGA差，可能更具侵袭性。肿瘤异质性是肿瘤发生进展的基本特征，研究其有助于改进治疗策略和预后。LTBP2属于LTBP-纤连蛋白超家族，与其他LTBP不同，不与TGF-β复合物形成共价键，但既往研究显示其在成纤维细胞中参与TGF-β合成和分泌并影响TGF-β通路活性。该研究揭示以LTBP2为中心的既往未认识调控回路，LTBP2在CGA中显著升高并与晚期TNM分期和不良预后相关，可能作为CGA恶性表型驱动因子；其他恶性肿瘤中LTBP2作用不同，如食管癌中通过激活Src信号促进进展和耐药，前列腺癌中通过PI3K/AKT抑制进展和转移，而其在CGA中的作用及异质性调控机制此前未明。研究强调PTM串扰：LTBP2被CRL3-SPOP-E3连接酶复合物泛素化并靶向蛋白酶体降解，SIRT1介导去乙酰化使LTBP2免受泛素化而增强稳定性；稳定化LTBP2激活TGF-β/PI3K-AKT轴，促进增殖和EMT，与侵袭、转移和治疗抵抗相关；LTBP2或SIRT1基因缺失削弱体内外肿瘤生长和EMT，SIRT1缺陷细胞重建LTBP2可挽救致癌表型，说明SIRT1促瘤作用很大程度上通过稳定LTBP2实现。EMT在肿瘤进展和化疗耐药中重要，研究发现LTBP2敲低降低肿瘤细胞TGF-β表达和分泌，KEGG及Western blot提示LTBP2经TGF-β/PI3K-AKT影响EMT；LTBP2敲低增强5-FU在细胞和小鼠模型中的疗效，提示靶向SIRT1-LTBP2轴可能克服CGA化疗耐药，监测LTBP2水平可能预测5-FU为基础化疗反应，但需更大前瞻性队列验证。IHC显示SIRT1表达与CGA分期和预后显著相关，且SIRT1与LTBP2在CGA和NCGA中正相关，CGA中SIRT1高于NCGA，提示靶向异质性蛋白或调控机制可能成为控制肿瘤进展的策略。局限包括主要功能验证依赖AGS和MFC细胞，需更多CGA来源细胞模型；临床队列样本量尤其NCGA中等，需多中心大队列确认LTBP2/SIRT1标志物预后价值；体内模型不能完全复现人类肿瘤微环境和转移级联。
研究结论（翻译）：总之，研究人员的工作揭示LTBP2是CGA中升高的异质性蛋白，并阐明其通过SIRT1依赖性去乙酰化而稳定。通过TGF-β/PI3K-AKT信号促进EMT和化疗耐药，LTBP2成为CGA进展的中心节点和有吸引力的治疗干预靶点。未来探索LTBP2靶向药物单用或联合常规化疗，可能为改善这种困难恶性肿瘤的结局提供新途径。
