《Scientific Reports》：Comparative evaluation of two automated magnetic-bead cfDNA extraction workflows in early colorectal cancer
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可靠的血浆游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）提取是液体活检检测的关键组成部分，需要标准化的分析前工作流程。研究人员对两种自动化提取方法——Maxwell RSC ccfDNA LV Plasma Kit和Maxwell RSC Rapid c
可靠的血浆游离DNA（cell-free DNA，cfDNA）提取是液体活检检测的关键组成部分，需要标准化的分析前工作流程。研究人员对两种自动化提取方法——Maxwell RSC ccfDNA LV Plasma Kit和Maxwell RSC Rapid ccfDNA Kit——进行了配对比较，使用了来自48例早期结直肠癌患者的EDTA血浆样本。每位患者4 mL血浆被分为两个2 mL等分样本，并在同一台仪器上按照制造商说明进行处理。游离DNA通过荧光法和毛细管电泳进行测量，结果采用线性混合效应模型分析，以提取试剂盒作为固定效应、患者作为随机截距。两种分析平台获得的测量值高度相关。与标准工作流程相比，快速工作流程在所有评估的浓度和片段分布终点均显示出显著更高的数值，包括总DNA浓度以及50–700 bp和100–300 bp范围内的片段回收率。在该早期结直肠癌队列中，快速工作流程较标准工作流程显示出更高的cfDNA回收率以及评估cfDNA大小范围内片段的更大代表性。这些发现仅限于上游提取和质量控制指标，并未确立改进的突变检测、分析灵敏度或对下游分子检测的适用性。研究结果表明，尽管仍建议进行本地分析验证，但该简化工作流程可作为常规血浆游离DNA提取的实用替代方案。
研究背景与问题
循环游离DNA（cell-free DNA，cfDNA），尤其是其中源自肿瘤的部分（circulating tumor DNA，ctDNA），已成为肿瘤学中成熟的微创生物标志物，广泛应用于诊断、治疗分层和纵向疾病监测。然而，液体活检检测的临床有效性和实用性高度依赖于端到端的流程标准化，其中最关键的是分析前阶段，该阶段直接决定cfDNA的产量、完整性和代表性。分析前阶段涵盖采血管类型、处理时间、离心条件、储存方式及提取方法等关键变量。近期专家共识强调，分析前变异以及验证和分析标准的差异可能导致结果不一致，并影响临床判读。因此，在常规实践中更换提取方法时，需要在代表性患者群体中进行等效性或优效性评估，以确保回收率、纯度以及对下游应用（如微滴数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）或二代测序（next-generation sequencing，NGS））的适用性等关键指标不受影响。
研究内容与结论
该研究旨在配对比较Maxwell RSC Rapid ccfDNA Kit（AS1590）与当前使用的Maxwell RSC ccfDNA LV Plasma Kit（AS1840），重点关注cfDNA回收率、片段大小分布及上游质量控制指标。两种试剂盒的主要区别在于样本制备、自动化程度、操作时间和周转时间：标准流程（AS1840）需45分钟手动血浆预处理步骤，总周转时间约90分钟；快速流程（AS1590）采用直接上卡盒工作流程，无需血浆预处理，自动化提取在30分钟内完成。研究采用单中心配对患者设计，共纳入48例早期结直肠癌患者，每例患者4 mL血浆分为两个2 mL等分样本，在同一台Maxwell RSC仪器上按制造商说明平行处理。结果显示，快速流程在所有评估的浓度和片段分布终点均显著高于标准流程，提示该简化工作流程可能作为常规血浆cfDNA提取的实用替代方案，但需结合预期下游分子检测进行本地验证。
主要技术方法
研究从48例早期结直肠癌患者（来自Hospital Clínico Universitario San Cecilio/Hospital Universitario Virgen de las Nieves）采集EDTA抗凝外周血，经双重离心（2,000 × g 10分钟，随后16,000 × g 10分钟）制备血浆。每例患者4 mL血浆分为两个2 mL等分样本，分别采用标准试剂盒（AS1840）和快速试剂盒（AS1590）在Maxwell RSC仪器上平行提取cfDNA。cfDNA定量采用两种互补方法：Qubit 4荧光计配合dsDNA HS Assay Kit进行荧光法测定，以及4200 Agilent TapeStation平台配合Cell-free DNA ScreenTape Assay进行自动化电泳片段分析。统计分析采用R软件（v4.5.1），使用线性混合效应模型（lme4包），以试剂盒为固定效应、样本ID为随机截距，并采用Grubbs检验识别离群值。
研究结果
数据质量控制。 配对血浆样本经两种流程处理后，通过Qubit荧光法和TapeStation电泳进行浓度读数质量控制，识别出1例存在基因组DNA污染证据的样本和3例Grubbs检验标记的离群值，均予以排除。
浓度相关性分析。 排除异常值后，Qubit与TapeStation浓度呈正相关（ρ = 0.85，校正R2 = 0.72）。描述性统计显示快速流程的cfDNA浓度一致更高：Qubit浓度中位数从标准流程的0.4 ng/μL（IQR 0.3–0.6）升至快速流程的0.6 ng/μL（IQR 0.4–0.8）；TapeStation 50–700 bp总cfDNA浓度从144 pg/μL（IQR 92–315）升至329 pg/μL（IQR 187–516）；100–300 bp片段浓度从120 pg/μL（IQR 77–270）升至273 pg/μL（IQR 145–461）。
片段分布分析。 快速流程在cfDNA预期大小范围内的片段比例更高：50–700 bp比例从84%（IQR 72–88%）升至97%（IQR 94–98%），100–300 bp比例从70%（IQR 55–75%）升至81%（IQR 75–84%）。代表性TapeStation电泳图谱显示，两种流程均呈现特征性单核小体cfDNA峰（150–180 bp），快速流程峰强度更高，但高分子量DNA区域未见相应增加，提示升高的cfDNA浓度并非主要来自基因组DNA携带污染。
线性混合效应模型分析。 为正式考虑患者内配对，对每个终点拟合线性混合效应模型，以试剂盒为固定效应、样本ID为随机截距。快速流程在所有评估的回收率和片段分布终点均显著高于标准流程（均p < 0.001），校正平均差异（快速?标准）为：Qubit浓度+0.19 ng/μL，TapeStation 50–700 bp浓度+197 pg/μL，TapeStation 100–300 bp浓度+163 pg/μL，cfDNA 50–700 bp比例+20%，cfDNA 100–300 bp比例+16%。方差分解显示，样本间变异占浓度终点观察方差的大部分（67–88%）以及cfDNA 100–300 bp比例的47%；总cfDNA比例是受残差变异影响最小的模型（19%）。
讨论与结论
讨论部分指出，快速流程在100–300 bp片段回收方面的显著提高（中位数273 pg/μL vs. 120 pg/μL）可能对下游液体活检应用具有意义，因为肿瘤来源DNA片段通常短于非肿瘤cfDNA部分且浓度较低，该大小范围内回收率的改善可能有助于低丰度ctDNA的分析。然而，这一发现的临床和分析意义需通过直接评估ctDNA回收率、突变检测和低变异等位基因频率灵敏度来确认。快速流程采用无酒精化学配方，可避免自动化提取过程中的酒精使用，可能减少有机溶剂携带污染的风险，但残留抑制剂及其对下游检测的潜在影响未在本研究中直接评估。研究局限性包括：仅使用每种试剂盒一个批次，未进行批次间、操作者间或运行间重复性测试；下游终点如ctDNA回收率、突变检测和变异等位基因频率一致性超出本研究范围。
研究结论为：在所评估的条件下，采用配对患者设计，Maxwell RSC Rapid ccfDNA Kit（AS1590）较Maxwell RSC ccfDNA LV Plasma Kit（AS1840）显示出更高的cfDNA回收率和评估大小范围内片段的更大代表性。结合其更短更简化的流程，这些发现支持将快速试剂盒作为常规cfDNA提取的实用替代方案。
