《Scientific Reports》：Untargeted metabolomics reveals a reproducible signature associated with fatal insulin intoxication
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致命性胰岛素中毒仍然难以诊断，因为胰岛素在死后迅速降解，限制了直接生化测量的可靠性。研究人员假设胰岛素过量会诱导全身性代谢改变，这些改变在胰岛素降解后仍持续存在，并可通过死后代谢组学捕获。基于高分辨质谱（HRMS）的代谢组学被应用于一个国家队列（2017–20
致命性胰岛素中毒仍然难以诊断，因为胰岛素在死后迅速降解，限制了直接生化测量的可靠性。研究人员假设胰岛素过量会诱导全身性代谢改变，这些改变在胰岛素降解后仍持续存在，并可通过死后代谢组学捕获。基于高分辨质谱（HRMS）的代谢组学被应用于一个国家队列（2017–2024年），包括51例致命性胰岛素中毒病例和用于比较的非胰岛素死亡病例。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型使用2017年至2022年间收集的病例进行训练。性能通过两个时间上独立的测试集（2023–2024年）、一个匹配验证队列（n=59）和一个异质性队列（n=154，包含14例胰岛素病例）进行评估。由91个特征组成的胰岛素相关代谢组学特征显示出可重复的区分能力。在匹配队列中，胰岛素中毒分类实现了100%的敏感性和73%的特异性。在异质性队列中，保持了100%的敏感性，特异性为72%。在两个测试集中均未观察到胰岛素假阴性。在酰基肉碱、脂肪酸/脂质以及嘌呤/核苷代谢物中观察到显著变化。致命性胰岛素中毒与一个可重复的代谢组学特征相关。虽然不适合作为确证性诊断方法，但高敏感性和无假阴性的结果表明其在死亡调查中支持排除胰岛素中毒方面具有潜在应用价值。
研究背景与问题
胰岛素中毒是法医学中诊断最具挑战性的死因之一。其核心困难在于胰岛素本身在死后会迅速降解，导致直接生化测量结果不可靠。这种不稳定性由来已久，使得区分外源性胰岛素给药与内源性胰岛素分泌变得极为复杂。胰岛素中毒可能源于意外过量、自杀或他杀，但死后确认往往困难重重。由于检测灵敏度的限制，以及死后重新分布、溶血和死前医疗干预等因素的干扰，即使未能检测到胰岛素，也无法排除胰岛素诱导的低血糖。因此，对胰岛素中毒的确认有时不得不依赖间接证据而非确凿的毒理学发现，这可能导致部分病例未被识别，引发了对真实发病率被低估的担忧。
胰岛素过量的作用机制决定了其诊断难度。过量胰岛素导致低血糖，进而引发下游一系列影响细胞能量代谢和底物利用的代谢紊乱。尽管胰岛素本身在死后可能无法检测，但其引发的低血糖下游代谢后果可能持续存在并在死后样本中被捕捉到。因此，依赖于直接检测外源性化合物的传统方法难以识别这类间接效应，尤其是在目标化合物不稳定或快速降解的情况下。
死后代谢组学提供了一种替代策略，它能够全面剖析反映死前即刻代谢状态的内源性代谢物图谱。该方法并非针对单一化合物，而是评估可能表征特定死因的多变量模式。近年来的研究表明，死后代谢组学在大规模死因筛查以及区分特定致死性疾病（如肺炎、阿片类药物中毒和低温症）方面展现出潜力。这些发现表明，即使常规毒理学靶点缺失或不明确，代谢组学特征仍可能在死后材料中保持可检测性。
此前的研究已初步证明，死后代谢组学能够识别出区分胰岛素中毒死亡与高血糖糖尿病昏迷及假定正常血糖对照病例的独特代谢特征。然而，该早期研究受限于可用胰岛素中毒病例数量，并且缺乏使用时间独立病例进行的验证。在将死后代谢组学方法应用于常规法医实践之前，必须建立其分析稳定性和可重复性。当前尚不清楚从回顾性胰岛素中毒病例中得出的代谢组学特征，在应用于后期收集的独立病例时是否能保持区分能力，以及在代表日常实践的异质性人群中是否依然有效。解决这些问题对于区分真正的生物学信号与模型过拟合至关重要。
本研究旨在通过大幅增加确诊胰岛素中毒病例数量，并采用时间分离的训练与验证框架，来评估胰岛素相关死后代谢组学特征的稳健性与可重复性，探索其作为法医死亡调查中补充生化证据的潜力。
主要技术方法
研究人员采用了以下关键技术方法：
- 1.
研究设计与样本队列：研究纳入瑞典国家法医委员会2017至2024年间所有尸检病例（n=40,595），从中筛选出51例确诊胰岛素中毒死亡病例。病例按年份分为训练队列（2017–2022年，n=37）和测试队列（2023–2024年，n=14）。训练集还包括高血糖糖尿病昏迷病例（n=37）和缢死对照组（n=71）。构建了两个测试集：匹配队列（Test Set 1，n=59）和反映法医工作异质性的随机队列（Test Set 2，n=154）。
- 2.
代谢组学数据获取：数据来源于常规毒理学筛查中对股静脉全血样本的高分辨质谱（HRMS）分析。样本经蛋白沉淀处理后，使用液相色谱-四极杆飞行时间质谱（LC-QTOF-MS）进行分析，数据采集跨越2017至2024年。
- 3.
多变量建模与特征选择：使用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）构建模型。首先构建两个OPLS-DA模型分别比较胰岛素中毒与对照组及高血糖组。随后通过共享与独特结构（SUS）图提取了91个与胰岛素中毒相关的特征，并基于这些特征重建了三组OPLS-DA模型。
- 4.
模型验证：使用时间独立的测试集对模型性能进行外部验证。预测前应用X空间距离（DModX）过滤器（α=0.01）定义模型适用域，以确保预测在有效模型空间内进行。
- 5.
代谢物注释与统计分析：通过内部库匹配和公共数据库比对进行代谢物推定注释。采用Wilcoxon秩和检验、Benjamini-Hochberg错误发现率（FDR）校正以及Cliff's delta非参数效应量估计来量化组间差异。
研究结果
1. 队列特征
研究人员从瑞典全国法医尸检数据库中筛选出51例确诊胰岛素中毒死亡病例，并按时间划分为训练集（2017–2022年，37例）和测试集（2023–2024年，14例）。训练集和匹配测试集（Test Set 1）中的各组在性别、年龄、身体质量指数（BMI）和死后间隔（PMI）上进行了匹配，无显著差异。异质性测试集（Test Set 2）旨在反映常规法医工作，其组间在年龄、BMI和PMI上也未见统计学差异。
2. 胰岛素中毒病例的区分与预测
基于训练集数据构建的OPLS-DA模型表现出良好的区分度。胰岛素与对照组模型的R2=0.91，Q2=0.70；胰岛素与高血糖组模型的R2=0.90，Q2=0.85。置换检验显示模型无过拟合。通过SUS图分析提取出91个与胰岛素中毒相关的特征，基于此构建的三组模型同样展现了有效的组间分离（R2=0.53，Q2=0.42）。
在独立测试集上的验证结果显示，在模型适用域内，胰岛素中毒分类在匹配队列（Test Set 1）和异质性队列（Test Set 2）中均达到了100%的敏感性，特异性分别为73.3%和72.5%，总体准确率分别为76.7%和75.5%。值得注意的是，在两个测试集的适用域内均未观察到假阴性，阴性预测值（NPV）达到100%。即使在未应用DModX过滤的情况下，胰岛素中毒病例的检出敏感性也保持在100%。
3. 代谢组学特征
对91个胰岛素相关特征的分析揭示了广泛的代谢物类别变化。与非胰岛素病例相比，胰岛素中毒病例中多个酰基肉碱、脂肪酸/脂质以及嘌呤/核苷代谢物表现出显著的丰度差异。Cliff's delta效应量分析表明，许多代谢物呈现出中等程度的组间分离效果，且效应方向在同一代谢物类别内具有一致性。排名前五的代谢物在组间的log?强度差异显著，并通过Wilcoxon秩和检验得到确认。
讨论与结论
讨论部分总结：本研究证实，胰岛素中毒与一个可重复的死后代谢组学特征相关，该特征在时间独立和异质性的法医人群中均保持了区分性能。这一发现表明，胰岛素过量的系统性代谢后果是持久的，并能通过分析手段捕获。研究的核心目标是评估回顾性得出的特征是否能在未来病例中保持可重复性，而时间分离的训练/验证设计为此提供了更严格的评估。在适用域内，两个测试集均未出现假阴性，阴性预测值达100%。与早期概念验证研究相比，本研究扩大了病例数并引入了时间独立验证，且发现约30%的先前报道的个体代谢物（如羟基化酰基肉碱、十二烷酰肉碱、7-甲基鸟嘌呤和鞘氨醇-1-磷酸）在本研究中再次被识别，支持了该特征的生物学稳定性。从生物学角度看，胰岛素过量导致的低血糖会抑制脂肪分解和脂肪酸氧化，这与观察到的多种酰基肉碱丰度下降一致。同时，嘌呤/核苷和膜相关脂质代谢物的相对升高，可能反映了继发于低血糖的细胞能量耗竭和应激反应。研究人员强调，该研究使用的是推定水平的代谢物注释，因此解释主要在代谢物类别层面。尽管如此，这些代谢物类别在不同队列中的可重复且生物学合理的行为增强了结论的可信度。从法医学角度而言，该特征可能为疑似胰岛素中毒案件提供补充性生化证据。重要的是，该特征在匹配和异质性队列中表现一致，支持其为稳定的生物学响应。鉴于高分辨质谱正越来越多地整合到常规法医毒理学筛查中，此类分析的实现几乎无需额外样品。本研究的优势包括：全国性单一实验室的标准化流程、时间独立的训练/验证设计、以及在两种不同条件下的性能评估。局限性包括：代谢物注释为推定水平、死后因素无法完全控制、回顾性数据可能存在批次效应、以及可用于验证的胰岛素中毒病例数量有限。尽管如此，该特征的一致性能支持其作为可靠生物学信号的存在。
研究结论部分翻译：总之，研究人员证明，死后代谢组学能够在一个全国法医队列和时间独立的验证环境中识别出与胰岛素中毒相关的可重复代谢组学特征。该胰岛素相关特征在匹配和异质性死后人群中保持一致，支持其代表稳定的生物学信号而非队列特异性伪影。观察到的代谢物类别改变与胰岛素诱导低血糖的系统性效应在生物学上一致，为所检测到的特征提供了生理学合理性。总的来说，这些发现表明，非靶向死后代谢组学可为疑似胰岛素中毒的调查提供补充性生化证据，尤其是在直接胰岛素测量不可靠或不明确时。虽然不适合作为独立的确定性诊断方法，但在验证的适用域内始终如一的高敏感性和无假阴性结果，表明其在法医死亡调查中支持排除胰岛素中毒方面具有潜在应用价值。需要在独立实验室和法医人群中进行进一步的外部验证，以确定更广泛的普适性和法医学适用性。
