基于nnU-Net的qHisto全自动组织学分割与量化用于MASH/MASLD评分及空间形态学分析

《Scientific Reports》：Automated segmentation and quantification of histological liver features for MASH/MASLD scoring

　　

代谢功能障碍相关脂肪性肝病（MASLD）（包括代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH））全球患病率不断上升，迫切需要客观的组织病理学评估。传统组织学方法耗时且主观。因此，研究人员提出一种基于深度学习（DL）的全自动流程，用于MASH/MASLD组织学肝特征的分割和表征。分割应用于45只小鼠和44例MASH/MASLD人类的H&E（苏木精-伊红）切片。qHisto（定量组织学）方法基于nnU-Net，量化MASH评分的组织学关键组分，包括脂肪变（steatosis）、纤维化（fibrosis）、炎症（inflammation）和气球样变（ballooning）。此外，研究人员确定了无法通过人工组织学获得的新的特征，如脂肪滴尺寸分布（distribution of fat droplet sizes）、核纵横比（nuclear aspect ratio）和热图（heatmaps）。qHisto参数与常规组织学评分呈强正相关（脂肪：R=0.91，炎症：R=0.70，气球样变：R=0.47），并与磁共振成像（MRI）肝脂肪分数（hepatic fat fraction, HFF）相关（R=0.87）。新型评分显示，核变形由大脂滴而非总体脂肪量驱动。该方法的关键优势是空间分辨的、精确的组织学量化，可对疾病严重程度进行详细评估。通过自动化耗时且重复的读数，qHisto提高了MASH/MASLD特征量化的标准化和可重复性，并提供可扩展的全切片分析，支持组织病理学家并增强临床评估。

研究背景与问题：MASLD及其进展性炎症纤维化阶段MASH与肥胖、2型糖尿病和代谢综合征流行并行，构成全球健康负担；进展为炎症表型伴纤维化可升高晚期纤维化、肝硬化、门静脉高压和肝细胞癌风险，并与肝脏相关及全因死亡增加相关。尽管术语演变以反映代谢驱动因素，临床仍需准确、可重复、可捕捉疾病活动的评估工具。H&E（苏木精-伊红）组织病理学仍是诊断、分期和临床试验疗效裁定的参考标准；MASH临床研究网络（CRN）MASH评分等半定量系统将连续组织变化压缩为序数类别并依赖专家知识，观察者内和观察者间变异已反复记录，削弱诊断一致性、纵向研究统计效能和疾病进展检测，且传统评分耗时、不常规量化空间组织或脂肪空泡分布。深度学习（DL）分割可在全切片尺度进行像素级量化，但现有MASH数字病理系统常依赖特殊成像、额外染色、应用特定流程，或主要聚焦常规评分/单一特征，部分系统非开放获取或仅提供聚合测量而缺乏详细空间信息。为此，研究人员提出qHisto（quantitative histology，定量组织学），一个基于自配置nnU-Net框架的全自动开放获取流程，目标为（I）以连续、客观和可重复测量重现既有评分系统关键要素；（II）以新的形态学和空间描述符扩展常规读数；并将MASH标准转化为形式化定量定义，以conHisto（常规组织学）和定量MRI验证。
技术方法（不超过250字）：研究人员基于nnU-Net v2构建qHisto，将全切片扫描切成5,000×5,000像素图块（气球样变模型1,000×1,000像素），训练五个分割模型分别处理脂肪变/炎症、纤维化、血管、气球样变、微泡性脂肪变与糖原化核；人工标注由KS完成并经AAK和TRK验证，五折交叉验证，以Dice/F1评估；后处理含血管近邻合并和小于10 μm细胞过滤，DBSCAN聚类量化小叶炎症，热图Gaussian平滑；MRI用two-point Dixon计算HFF。样本为45只雄性C57BL/6l小鼠（胆碱缺乏L-氨基酸定义高脂饮食，四个饮食持续时间组加对照，MRI HFF）和29例局灶性肝病变肝切除患者（13男/16女，10例术前MRI HFF）；另有12份RGW and KH及3份Biospecimen Research Database人类扫描仅用于训练，排除统计比较；分割训练/应用涉及45只小鼠和44例人类H&E切片。
研究结果：
自动分割特征：模型被训练分割MASH/MASLD相关的多种组织学特征，并应用于人类和小鼠肝脏扫描；相应Dice和F1分数平均五折确认了这些特征预测的性能，结论是qHisto可对多种关键结构进行自动分割。
量化评分验证：通过qHisto与conHisto及MRI HFF的相关性验证定量评分。小鼠脂肪面积随饮食和时间的行为与HFF相似，即时间点0很低、升至时间点2、降至时间点4，而conHisto评分在时间点1后达平台；qHisto脂肪面积与MRI脂肪体积在合并队列中正相关（R=0.87，p=0.74×10^?17），小鼠R=0.86（p=7.27×10^?14）、人类R=0.83（p=2.71×10^?3）；脂肪面积与conHisto脂肪变分级合并相关R=0.91（p=0.91×10^?28），小鼠R=0.67（p=6.65×10^?7）、人类R=0.93（p=1.23×10^?13）。结论是面积法脂肪定量与常规分级及MRI脂肪负荷一致。
新指标：核纵横比与脂肪面积在合并队列中正相关（R=0.80，p=3.32×10^?20），时间点3和4形成明显分组；未合并队列中小鼠R=0.47（p=2.48×10^?4）、人类R=0.45（p=1.41×10^?2）。脂肪滴直径偏度在小鼠时间点3和4升高并形成明显分组，但人类每例仅一个时间点，无法观察该时间行为；伸长核比例与qHisto脂肪面积在合并队列中强正相关（R=0.78，p=4.28×10^?18）。结论提示核变形与较大脂肪滴相关，而非仅与总脂肪面积相关。
qHisto的MASH评分：将量化参数转化为MASH评分，包括微泡性脂肪变、纤维化、小叶炎症、门管区炎症、气球样变和糖原化核。微泡性脂肪变密度在conHisto 0与1之间无差异（AUC=0.55）；纤维化面积与conHisto正相关（R=0.51，p=0.47×10^?5），0 vs 1–2的AUC=0.80、0–1 vs 2的AUC=0.83；小叶炎症采用每灶至少5个炎细胞时相关R=0.70（p=0.77×10^?11），炎症灶密度区分AUC为0 vs 1–3=0.92、0–1 vs 2–3=0.85、0–2 vs 3=0.74；门管区炎症0 vs 1的AUC=0.69；气球样变密度与conHisto相关R=0.47（p=0.23×10^?4），AUC为0 vs 1–2=0.79、0–1 vs 2=0.98；糖原化核密度0 vs 1的AUC=0.92。qHisto与两位病理学家的Cohen’s kappa多数为轻微或一般一致（病理学家A与qHisto中位数0.39，范围0–0.62；病理学家之间中位数0.47，范围?0.01–0.52）；17例气球样变不一致病例的盲法复核中，51个图块仅2个正确检测气球样肝细胞，主要错误为假阳性检测非气球样肝细胞导致高估。结论是qHisto评分与常规评分总体相关并可区分等级，但气球样变自动识别仍具挑战。
新空间分析：多特征分割支持详细空间分析；除基于既有分区定义的定位评分外，还生成微泡性脂肪变、炎症、气球样变和糖原化核热图。微泡性脂肪变细胞呈簇集但与血管结构无直接关系；炎症热图显示均匀背景及靠近门静脉（PV）的炎性浸润簇，提示门管区炎症范围（conHisto评分=1）；气球样变热图背景异质且气球样细胞距血管更远；糖原化核呈簇集并避开中央静脉（CV）区域。结论是空间热图可提供常规评分之外的组织分布信息。
讨论总结：研究人员将qHisto与已有方法比较。既往DL分割多聚焦单一特征如核或脂肪变且无新形状描述；NucleiSegNet核分割F1=0.84，而qHisto核分割F1=0.74，但qHisto同时分割多种MASH特征。Heinemann et al.自动预测4项MASH评分，qHisto可估计8项MASH评分，主要优势在详细形态测量；与病理学家A比较，Heinemann et al.的脂肪变分级Cohen’s kappa为0.66而qHisto为0.00、0.22，纤维化为0.62而qHisto为0.27、?0.05，小叶炎症为0.24而qHisto为0.36，气球样变为0.43而qHisto为0.62。气球样变自动识别尤其困难，其形态需相对周围肝细胞判断，且种属差异明显；qHisto气球样变模型主要反映人类形态，对小鼠组织应谨慎解释。AIM-MASH有多中心临床验证，HistoIndex和FibroNest提供胶原形态连续评估，MorphoQuant和Visiopharm展示临床前自动定量价值；qHisto在公开框架内结合常规H&E更广结构分割与形态、空间输出。QuPath主要用于交互使用，不适合大队列重复特征计算；qHisto面向大 cohort 自动客观分割量化。Panzeri et al.用ChatGPT-4在Sirius red染色中按MASH-CRN分期，病理学家选择视野Cohen’s kappa=0.90、随机裁剪0.75，而qHisto纤维化与病理学家A的kappa=0.27，但大语言模型方法仅产生分类标签，不能像素级量化空间分析。qHisto重建了较高比例MASH评分；除微泡性脂肪变和糖原化核外，qHisto参数均与conHisto正相关，糖原化核非特异且不在MASLD Activity Score中，应视为探索性扩展。病理学家A与B的一致性质量与A与qHisto相近；qHisto脂肪面积与MRI HFF强关联提供独立验证，支持脂肪面积作为总体肝脂肪负荷连续指标，但不直接重现基于细胞的常规脂肪变分级。Sethunath et al.和Esparza et al.已实现H&E脂肪变自动定量，后者用20×20 μm²网格估计受累肝细胞；qHisto因H&E中单个肝细胞边界不能可靠分割而直接测脂肪面积，其与常规分级及MRI HFF的强关联支持该法。qHisto可用同一流程分析小鼠和人类样本，观察到可比定量趋势，但大泡性脂肪变在人与小鼠的发生和生物学解释不同，且未合并队列并非所有参数均显示相似相关，未来需更多队列。定位分析结合预定义区可客观评估所有提取特征；新参数显示总脂肪面积下降时脂肪滴直径偏度仍可增加，提示少数大脂滴导致核变形，伸长核比例与脂肪面积强正相关支持该发现，并与脂滴作为细胞内应激源使肝细胞核变形的力学生物学研究一致；qHisto据称是首个在常规H&E中提供小鼠和人类MASH/MASLD全切片核变形自动定量读数的方法。局限性包括：纤维化分期仅基于H&E，相关 modest，面积法不显式捕捉桥接纤维化，小鼠无纤维化且人类晚期纤维化不足，无法全范围验证，无胶原特异染色，H&E纤维化参数应视为探索性补充而非替代胶原染色或常规分期；训练和验证队列大小与组成有限且无外部验证，阈值需谨慎，人队列全为肝切除标本而非针活检，针活检性能和空间分析泛化性未建立；稀有或结构复杂特征如窦状隙、血管、微泡性脂肪变和糖原化核的Dice/F1较低，但部分qHisto测量仍与conHisto良好一致。
研究结论（翻译）：研究人员引入qHisto，一种用于MASH/MASLD组织学评分的全自动分割与量化工具，以实现（I）对MASH特征及相应MASH评分的客观高效评估；该框架能分割和量化两个物种中最相关特征，而各关联强度在物种间存在差异。（II）除常规参数外，qHisto方法还能量化超出MASH评分的特征，包括肝细胞核形状和基于热图的空间分析；未来有潜力扩展至其他组织、特征和染色。qHisto量化的指标经conHisto或定量MRI验证；所有参数与MASH评分呈正相关甚至高度一致，基于特定阈值进行区分可行，AUC多升高。因此，qHisto有潜力促进MASH/MASLD等肝病的诊断及治疗干预进展。