《Journal of Human Genetics》：Neuromuscular junction pathology in amyotrophic lateral sclerosis and emerging molecular therapeutic strategies
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传统上被概念化为以胞体为中心的病理过程，肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）是一种致死性的、异质性神经退行性疾病。以中枢神经系统（central nervous system, CNS）为靶点的治疗策略所获得的
传统上被概念化为以胞体为中心的病理过程，肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis, ALS）是一种致死性的、异质性神经退行性疾病。以中枢神经系统（central nervous system, CNS）为靶点的治疗策略所获得的不理想结局，迫使研究焦点转向dying-back假说。该假说认为，远端神经肌肉接头（neuromuscular junction, NMJ）处的突触失联与轴突回缩是早期病理事件，可能先于明显的运动神经元丢失。本综述系统性地将NMJ审视为ALS发病机制中一个早期易损且具有治疗可及性的外周微环境，而非仅仅是近端蛋白病的下游后果。来自人类临床样本及ALS小鼠模型（尤其是SOD1-G93A小鼠）的证据共同支持NMJ的早期易损性，其中去神经支配、突触回缩和线粒体功能障碍的时间先后顺序在实验模型中得到了最清晰的展示。研究人员重点阐述了由运动末梢、骨骼肌和终末施万细胞（terminal Schwann cells, tSCs）组成的三方突触的瓦解如何可能破坏必需的神经营养信号传导与局部代谢稳态。此外，研究人员讨论了人源化体外NMJ模型及空间转录组学（spatial transcriptomics）的进展如何为局部RNA代谢紊乱和生物能量衰竭提供前所未有的高分辨率解析。最后，研究人员评估了专门旨在稳定或修复NMJ的新兴治疗策略，包括MuSK激动剂及其他以NMJ为靶点的干预手段。通过将NMJ重新定位为关键的早期易损位点，研究人员提出，靶向外周突触微环境可能为修饰ALS疾病进展提供一种有前景的策略。
引言
ALS是一种致死性、成年起病的疾病，以上运动神经元和下运动神经元的进行性退化为特征。传统上，ALS被视为一种以运动神经元胞体病理为主的“胞体中心”疾病；然而，越来越多的证据支持dying-back假说，即远端轴突和NMJ在疾病过程中早期即变得易损。NMJ是运动神经元向骨骼肌传递乙酰胆碱介导信号的化学突触，已明确该远端突触的突触失联可先于明显的运动神经元丢失和临床无力。为阐明外周复杂的病理机制，学界长期依赖多种小鼠模型，尤其是SOD1和TDP-43突变株。基于1993年首次鉴定的ALS致病基因SOD1的SOD1-G93A模型，能够再现进行性功能损害，对于从症状前期到终末期追踪NMJ病理至关重要——这一过程无法在人类中纵向观察。利用该模型已证明，NMJ的形态学去神经支配和突触板碎裂在症状出现前数周至数月即已发生。与此同时，TDP-43模型对于研究ALS的主要病理标志不可或缺，因为胞质TDP-43错定位见于90%–95%的ALS患者。然而，这些小鼠模型虽提供了重要见解，但小鼠与人类NMJ在大小、结构复杂性及周围tSCs动态方面存在显著物种差异，这已成为将小鼠临床前研究的可喜成果转化为人类临床治疗的主要障碍。在此背景下，开发能够捕获人类特异性易损性并提高药物发现精度的人iPSC来源体外NMJ模型，已成为当前ALS研究不可或缺的前沿方向。由于ALS是一种异质性疾病，NMJ去神经支配、远端轴突病与运动神经元胞体退变之间的时间关系可能因遗传背景和疾病亚型而异。本综述将NMJ定义为ALS的早期易损且具有治疗可及性的外周微环境，而非唯一的原发起源。通过全面审视由运动神经元末梢、骨骼肌和tSCs组成的三方突触内信号串扰的破坏，讨论NMJ作为修饰ALS疾病进展的下一代治疗靶点的潜力。
NMJ结构
突触后肌膜含有高密度烟碱型乙酰胆碱受体（nAChRs）簇，正对突触前活性带。在NMJ发育过程中，运动神经末梢释放的agrin与突触后低密度脂蛋白受体相关蛋白4（LRP4）结合，随后激活肌肉特异性受体酪氨酸激酶（MuSK）和Dok-7信号复合体。该级联反应作为突触分化的主调控因子，最终通过rapsyn等支架蛋白诱导nAChRs的高密度聚集，并将其锚定至肌动蛋白细胞骨架。
dying-back假说的证据
早期大多数ALS研究主要围绕运动神经元退变展开，很大程度上是因为普遍认为骨骼肌改变仅是神经元丢失的继发后果。远端受累假说源于以下观察：下运动神经元丢失显著重于上运动神经元，且轴突完整性丧失导致NMJ功能障碍。dying-back假说得到有力支持：仅限骨骼肌表达的突变SOD1（由肌肉特异性启动子驱动）可促成运动神经元退变。此外，通过Bax缺失或p38 MAPK抑制来保护运动胞体并不能阻止SOD1-G93A小鼠的NMJ去神经支配，表明NMJ功能障碍是早期且机制上重要的事件，而非仅晚期副产物。因此，由复杂分子信号维持的NMJ，因其精细的分化和维持机制，代表ALS病理中高度易损的部位。NMJ功能崩溃和逆行性退变先于胞体运动神经元死亡的观察，强调了NMJ是疾病表现的早期位点和候选治疗靶点。
ALS中NMJ的病理（临床发现）
人类NMJ研究面临诸多挑战，包括样本采集、建立年龄、性别和病史匹配的对照组，以及与完整病史和家族史的相关性分析。由于多数ALS病例为散发性，症状前采样不可能，诊断后多时间点采样困难，限制了疾病进展评估。因此，必须明确区分人类ALS样本直接观察到的发现、小鼠模型纵向获得的发现以及实验系统推断的机制解释。尽管存在这些挑战，仍有信息丰富的发现：结合肌肉活检、尸检和电生理评估的研究表明，NMJ功能障碍在ALS病理进展早期起关键作用。早期使用简单AChR染色方法的研究显示，ALS患者终板碎片化数量高于对照组，但与临床分期无关。双重染色技术和电镜分析进一步揭示了去神经支配和终板碎片化证据，以及神经末梢线粒体数量减少。喉肌分析也确认了包括去神经支配和突触裂隙扁平化在内的多种病理改变，甚至发现NMJ再生的可能迹象。ALS患者NMJ病理的进一步分子特征包括AChR亚基表达改变、Nogo-A表达增加及突触前电压门控钙通道亚基表达改变。
眼外肌（EOM）群是ALS肌肉去神经支配模式的一个例外。EOM受ALS影响比肢体肌、躯干肌和延髓肌轻。这种相对抵抗为理解NMJ易损性提供了有益对比。EOM表型提示运动神经元易损性部分取决于受支配肌肉及其突触微环境的特性。支配EOM的运动单位具有独特的钙处理和营养支持特征，包括表达小清蛋白和钙结合蛋白-D28k等钙结合蛋白，以及局部富集的GDNF、BDNF和IGF-1等神经营养因子。其结构可塑性，包括多重支配的“en grappe”终板，也可能支持突触韧性。
在尸检肢体肌肉中，tSCs标志物S100B和p75NTR的染色强度均降低。然而在EOM中，虽未检测到S100B标记，p75NTR仍存在，提示S100B蛋白下调而非tSCs丢失。其他研究显示，表达S100的tSCs在肋间肌中沉积补体激活产物，并在三角肌和肱三头肌中向神经末梢与AChR之间的突触裂隙延伸异常胞质突起。这些累积证据表明ALS患者NMJ存在形态、分子和功能改变。虽然人类尸检和活检研究无法直接确定这些NMJ改变是否先于运动神经元丢失，但与临床前纵向数据结合解读时，这些发现有力支持dying-back假说中外周突触的早期易损性。
ALS小鼠模型
ALS小鼠模型研究，尤其是SOD1突变和TDP-43模型，提供了从症状前期到终末期的全面疾病过程视图，填补了人类尸检分析的空白。这些模型的关键贡献在于定义了dying-back过程的时间序列，证明NMJ去神经支配可先于临床症状出现或脊髓运动神经元胞体丢失。此外，这些研究表明多种分子损伤可汇聚于共同终点：NMJ的功能和结构崩溃。这种汇聚支持将NMJ衰竭视为驱动后续逆行性轴突退变的关键事件。
小鼠模型阐明，运动神经元退变并非随机过程，而是依据所支配肌纤维类型遵循高度选择性顺序。快疲劳运动神经元体积大且具有广泛外周分支，最先经历NMJ突触脱离。相反，支配慢肌纤维的较小运动神经元表现出显著韧性，常通过终末发芽和再支配尝试补偿丢失的连接。这种易损性层级强调，维持远端突触的代谢和结构负担是决定哪些神经元首先衰竭的主要因素，强化了远端轴突和NMJ区室在ALS进展中的重要性。
NMJ本质上是线粒体丰富的结构，需要密集的局部线粒体群体提供神经传递、囊泡循环和钙稳态所需的ATP。因此，线粒体功能障碍是小鼠模型中NMJ最早可检测的病理之一。电镜揭示突触附近受损线粒体积累和结构崩解。这种局部能量危机因轴突运输受损和氧化应激增加而进一步加剧，共同损害维持远端突触所需的代谢机制。无论初始分子触发因素如何，这种局灶性生物能量衰竭是突触不稳定的关键驱动因素。
TDP-43蛋白病是约90%–95% ALS病例公认的常见分子标志，以蛋白的病理性胞质错定位为特征。近期研究强调了轴突中的毒性功能获得，错定位的TDP-43形成核糖核蛋白（RNP）凝聚体，隔离编码必需线粒体蛋白的mRNA。这种隔离抑制远端轴突的局部翻译，促成NMJ观察到的线粒体耗竭和能量衰竭。此外，TDP-43异常与agrin（一种对NMJ结构维持至关重要的蛋白）的剪接缺陷相关。然而，ALS是异质性疾病；某些家族性形式，如与SOD1或部分FUS突变相关的形式，通常不表现TDP-43病理，表明其他机制可独立导致相似的NMJ衰竭结局。
向不可逆NMJ衰竭的进展也受到周围微环境的强烈影响，包括星形胶质细胞、小胶质细胞和tSCs等非神经元细胞。在ALS模型中，这些细胞表现早期反应性改变，可释放促炎因子加速突触脱离。TDP-43病理和其他分子衰竭也见于这些胶质细胞和骨骼肌纤维中，破坏突触健康所需的三方串扰。疾病相关微环境可能抑制成功再支配并加速NMJ的结构解体。这些相互关联的机制——代谢崩溃、RNA代谢紊乱和胶质毒性——共同导致外周突触崩溃，促进dying-back级联反应。
人类体外NMJ模型与先进方法学
尽管体内小鼠模型对dying-back假说提供了不可或缺的见解，但由于NMJ结构和胶质细胞动态的固有物种间差异，将这些临床前发现转化为人类临床试验仍是重大挑战。为克服这些局限并准确捕获NMJ的人类特异性易损性，发展人源化实验平台至关重要。组装模型将独立分化的细胞类型共培养于同一培养板。早期方法利用hPSC来源的运动神经元和骨骼肌二维共培养，但存在缺乏tSCs和空间控制困难等局限。引入施万细胞的三细胞共培养系统可促进AChR簇形成。微流控装置进一步实现了不同细胞类型空间和时间排列的精确控制。将ChR2导入运动神经元可实现肌肉收缩的光遗传控制，促进模拟自主运动的人类体外NMJ模型发展。组装模型的独特优势在于允许来自健康个体或患者的不同遗传背景细胞自由组合，从而检验疾病突变的细胞类型特异性效应。利用NMP的自组织模型是另一关键策略。这些细胞具有生成神经和中胚层谱系的能力，有效模拟NMJ发育复杂性。在三维神经肌肉类器官（NMOs）中，这些祖细胞自组织为特定区域，并在40–50天内形成含运动神经元、骨骼肌和外周施万细胞的功能性可收缩NMJ。最先进的形式是三维assembloid，融合大脑皮层、脊髓和肌肉组织的不同类器官以模拟复杂神经肌肉回路。该三维模型已成功再现与C9ORF72和TDP-43突变相关的ALS表型，如NMJ尺寸减小、AChR聚集改变和肌肉收缩受损。为应对大规模三维结构的高通量挑战，也已开发使用NMP的二维自组织NMJ模型，可再现SMA等疾病表型并支持多孔板长期培养，便于高通量药物发现筛选。
尽管取得这些进展，体外NMJ建模仍面临重大挑战。形态和结构不成熟仍是主要障碍；多数体外模型缺乏成熟体内NMJ特有的深接合褶，且主要表达胎儿型而非成人型AChR亚基。此外，离子通道表达不足阻碍成熟电生理放电，线粒体密度低可能低估ALS病理核心的严重能量危机。再现年龄相关病理本质困难，因为TDP-43聚集等标志事件可能需要延长培养或额外应激源，而年轻的iPSC来源细胞难以模拟。为克服这些障碍，研究人员正在探索直接重编程技术以绕过iPSC表观遗传重置并保留供者年龄。其他有前景的策略包括结合电刺激诱导物理性肌肉成熟的三维组织工程，以及利用progerin表达或氧化应激鸡尾酒诱导衰老的方法。
空间组学的引入与先进体外模型一道，开始改变捕获疾病动态的方法。空间转录组学能够在保留解剖位置信息的同时构建NMJ的综合基因表达图谱，而这些信息在批量RNA-seq或单细胞分析中通常丢失。在ALS背景下，空间分析开始揭示多胺代谢改变和局部氧化应激反应，这些变化发生在特定肌肉区域和邻近tSCs中，甚至先于明显去神经支配。该技术对于在三维空间中捕获三方突触内的异常细胞间串扰以及识别微环境中的局部治疗靶点至关重要。
为促进高通量药物筛选，二维自组织NMJ模型已开发并展示多孔板格式的功能连接和疾病表型。利用患者来源干细胞，这些可扩展平台为评估个性化治疗反应提供了关键基础。这些人类体外模型的持续完善，结合体内研究获得的机制见解，可能大幅改善药物发现。
当前与新兴治疗策略
针对ALS机制的大量治疗干预已被尝试，但ALS的高度复杂性使疾病修饰治疗极为困难。因此，仅少数治疗获FDA批准。利鲁唑（Riluzole）于1995年首次获批，部分通过调节谷氨酸能神经传递发挥作用，可延长生存约2–3个月，但不能延缓疾病发作。依达拉奉（Edaravone）于2017年首次获批静脉制剂、2022年获批口服混悬液，是一种自由基清除剂；其临床获益应谨慎描述，因效果在选定的早期患者群体中最为显著，真实世界生存估计仍属观察性。AMX0035是苯丁酸钠和牛磺熊去氧胆酸的组合，旨在靶向内质网和线粒体应激，在II期CENTAUR试验中初步显示希望；然而后续III期PHOENIX试验未达主要终点，RELYVRIO/ALBRIOZA在阴性结果后已从美国和加拿大市场撤出。该案例可作为系统性神经保护策略难以转化为稳健临床获益的例证。
近期，tofersen于2023年获FDA加速批准用于SOD1-ALS成人患者。作为一种反义寡核苷酸（ASO），tofersen促进RNase H介导的SOD1 mRNA降解并减少SOD1蛋白产生。批准基于神经丝轻链降低作为替代终点；因此，持续临床获益应描述为仍在持续评估中而非已确证。由于这些药物无法逆转晚期疾病状态，多学科支持治疗仍是维持生活质量的核心。
在临床前和早期临床研究领域，治疗策略日益聚焦于稳定和修复NMJ以抑制逆行性退变。既往评估重组神经营养因子（如rhCNTF和BDNF）的临床试验未显示临床疗效，主要由于不利的药代动力学特性、短半衰期和有限的靶位递送。为克服这些局限，当前临床前策略正在研究高特异性TrkB激动剂和激动剂抗体，在NMJ局部模拟BDNF介导的存活信号以提供靶向营养支持并促进再支配。此外，补体抑制剂正被研究以阻止外周突触的不适当免疫激活。同时，增强神经传递的功能维持疗法也在积极研究。例如，毒蕈碱M2受体拮抗剂（如metoctramine）旨在通过阻断突触前自身受体增强神经肌肉支配，从而减少乙酰胆碱（ACh）释放的自身抑制。在临床前小鼠模型中，静息期给予这些拮抗剂已在NMJ显示显著保护效应。此外，靶向RNA代谢异常和局部信号通路的分子策略也在积极研究。miR-206是一种肌肉特异性microRNA，其在ALS中自然增加以促进再支配，正被探索作为模拟物以进一步稳定NMJ结构并延缓疾病进展。相关研究还鉴定了miR-126，其通过肌肉细胞外囊泡从骨骼肌分泌并对运动神经元发挥神经保护作用。与此同时，ASO策略正被开发以纠正TDP-43功能丧失引起的下游RNA加工缺陷，包括STMN2剪接异常，而非直接阻止所有TDP-43错定位。
结论
来自转基因小鼠模型的日益增多的证据及支持性临床观察强化了dying-back假说，将NMJ病理定位为ALS发病机制中的关键早期特征，而非运动神经元丢失的晚期继发后果。本综述强调，NMJ的功能和结构崩溃涉及线粒体功能障碍、RNA代谢紊乱（尤其是TDP-43蛋白病）以及三方突触内信号串扰破坏之间的复杂相互作用。转化格局正在发生重大转变。人类特异性体外模型的整合正变得越来越重要，不仅用于基础机制研究，也用于靶点验证和候选药物优化。近期MuSK激动剂项目已利用人iPSC来源NMJ平台评估靶点参与和突触稳定化，说明人源化系统如何帮助弥合啮齿动物模型与人类生理之间的差距。这些人源化“芯片上器官”系统为在大规模临床试验前表征作用机制和优化治疗候选药物提供了关键证据。通过利用高保真人类模型优化药物发现，并将治疗窗口转向外周突触衰竭的最早阶段，未来研究可能提高为ALS患者开发疾病修饰干预的可能性。
