Paracoccus marcusii IHA034对氧化鱼油与H2O2诱导小黄鱼肠道损伤的保护效应：体内外Keap-1/Nrf2应答差异

《Antioxidants》：Paracoccus marcusii IHA034 Protects Larimichthys polyactis Against Oxidized Fish Oil and H2O2-Induced Intestinal Injury: Divergent Keap-1/Nrf2 Responses In Vivo and In Vitro

　　

Paracoccus marcusii 是一种可合成虾青素的细菌，具有抗氧化潜力，但其缓解鱼类肠道氧化损伤的机制仍不清楚。本研究结合体内氧化鱼油（oxidized fish oil, OFO）挑战模型和体外H₂O₂（过氧化氢）刺激的原代肠道细胞模型，探讨P. marcusii IHA034（CGMCC No. 25301）对幼鱼Larimichthys polyactis的保护作用。51 d投喂试验显示，1.0 g/kg日粮补充P. marcusii可改善生长性能、增强肠道抗氧化酶（antioxidant enzymes）活性，并修复上皮超微结构损伤。在PM1.0组肠道食糜中检测到异常高的Paracoccus相对丰度（90.50%），并伴随微生物α-多样性（α-diversity）降低。体内肠道转录组学和实时定量PCR（qPCR）显示nrf2 mRNA下调，同时补体和抗凋亡反应被激活。然而，P. marcusii富含色素的粗提物在体外激活Keap-1/Nrf2（Kelch样ECH关联蛋白1/核因子E2相关因子2）通路，并挽救H₂O₂诱导的细胞损伤。这些发现表明P. marcusii IHA034具有多模式保护作用，并揭示了体内肠道组织与体外细胞模型之间相反的Keap-1/Nrf2调控模式，为这种产虾青素细菌资源在水产养殖中的应用提供了机制支持。

在高密度海水养殖中，鱼类持续面临水质恶化、操作运输应激及饲料源性氧化损伤等挑战。鱼油富含高不饱和脂肪酸，加工和贮藏过程中易发生脂质过氧化，产生脂质过氧化物及丙二醛（malondialdehyde, MDA）等次级氧化产物。日粮氧化鱼油（oxidized fish oil, OFO）可促进鱼体组织活性氧（reactive oxygen species, ROS）过量产生、耗竭内源抗氧化防御、损伤肠上皮超微结构、破坏紧密连接依赖的物理屏障、诱发慢性黏膜炎症、扰乱肠道菌群稳态并削弱免疫能力，最终抑制生长。肠道是饲料源性氧化毒性的主要靶器官，维持肠道氧化还原稳态是缓解氧化损伤的重要策略。虾青素具有清除自由基和增强细胞抗氧化能力等活性；Paracoccus属因培养周期短、培养条件简单、可合成抗氧化活性较强的(3′S, 3′S)-虾青素且安全性较好而受到关注。但Paracoccus的生物学活性具有明显菌株特异性，其抗氧化保护作用是否来自虾青素相关活性成分还是完整菌体的整体刺激，以及是否参与Keap-1/Nrf2（Kelch样ECH关联蛋白1/核因子E2相关因子2）抗氧化信号轴调控，仍不清楚。Larimichthys polyactis是黄海和东海重要经济鱼种，养殖中常见肠道损伤和生长迟缓。研究人员此前从L. polyactis肠道黏膜分离获得P. marcusii IHA034（CGMCC No. 25301），并采用体内氧化鱼油挑战试验和体外H₂O₂细胞氧化损伤模型，结合肠道菌群测序与肠道转录组分析，比较体内外Keap-1/Nrf2相关分子响应。

研究人员开展的51 d饲养试验表明，1.0 g/kg冻干P. marcusii菌粉可改善氧化鱼油应激下幼鱼生长性能，提高血清和肠道抗氧化酶活性，修复肠上皮超微结构损伤；体外活菌共培养及色素粗提物预处理均可缓解H₂O₂诱导的原代肠道细胞损伤。研究还发现，体内肠道组织nrf2 mRNA下调，而体外色素粗提物处理上调nrf2并抑制keap-1，显示体内外Keap-1/Nrf2调控模式存在差异。该研究为P. marcusii作为产虾青素微生物资源在水产抗氧化微生态制剂中的应用提供了机制线索，并提示简化细胞模型结论不能简单外推至完整肠道组织。

关键技术方法如下：养殖试验在浙江省舟山市浙江舟山渔业研究所朱家尖研究基地进行，初始幼鱼540尾（10.40±0.11 g）随机分为6组，每组3个重复、每桶30尾；基础日粮添加0、0.5、1.0、1.5、2.0 g/kg冻干菌粉，并在51 d试验最后7 d以3%氧化鱼油构建短期氧化应激模型，氧化鱼油过氧化值（POV）为375.2 meq kg^?1。采集肠道食糜进行16S rRNA V3–V4高通量测序，中肠组织用于透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）观察和肠道转录组测序，并以实时定量PCR（quantitative real-time PCR, qPCR）验证差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）。原代肠道细胞分离自健康L. polyactis中肠组织，采用H₂O₂损伤模型，设置活菌Transwell共培养和色素粗提物预处理，检测抗氧化指标及抗氧化、屏障相关基因表达。

研究结果：3.1 P. marcusii接种对L. polyactis生长性能的影响：OFO组终末体重、增重率和特定生长率数值最低但较CON组无显著差异；补充P. marcusii显著改善氧化鱼油应激下生长参数，PM1.0组最优，终末体重31.90 g、增重率205.48%、特定生长率2.19% d^?1，添加至2.0 g/kg时促生长作用下降；存活率和肥满度组间无显著差异，确定1.0 g/kg为后续研究剂量。3.2 不同水平P. marcusii菌粉对血清和肠道抗氧化活性的影响：OFO组三种抗氧化酶活性显著低于PM1.0组；PM1.0组血清SOD、CAT、GSH-PX数值较高，MDA为13.99 nmol/mL、SOD为21.81 U/mL、CAT为20.38 U/mL、GSH-PX为346.31 U/mL；肠道PM1.0组抗氧化谱最佳，MDA为1.21 nmol/mg prot、SOD为106.61 U/mg prot、CAT为39.47 U/mg prot、GSH-PX为257.90 U/mg prot。3.3 不同浓度P. marcusii对肠道细胞TEM观察：OFO组微绒毛长短不一、排列紊乱并部分扁平化，细胞质广泛空泡化，多数线粒体肿胀、嵴溶解或破坏，细胞间隙增宽；PM1.0组病变明显减轻，微绒毛恢复规则排列，线粒体肿胀和空泡化减弱，细胞连接保持完整。3.4 L. polyactis肠道菌群分析：基于Bray–Curtis距离的主坐标分析（principal coordinate analysis, PCoA）显示OFO与PM1.0组肠道食糜菌群明显分离，PERMANOVA（permutational multivariate analysis of variance）显示组间差异显著（R²=0.9214，p=0.001）；PM1.0组Shannon和Simpson指数显著降低，Chao1略高但差异边缘，Good’s coverage组间相当；门水平上PM1.0组变形菌门相对丰度升高，厚壁菌门和拟杆菌门降低；属水平上Paracoccus在PM1.0组平均相对丰度达90.50%，OFO组仅5.47%；16S rRNA V3–V4仅能分辨至属水平，不能确认所补IHA034菌株定植；FAPROTAX和Tax4Fun2预测显示两组潜在功能谱存在差异。3.5 转录组测序与生物信息学分析：OFO与PM1.0组间鉴定到1183个DEGs，其中630个上调、553个下调；GO富集主要涉及凋亡、细胞存活、增殖和信号转导，KEGG前15条通路中4条与炎症、免疫调节、抗氧化及氧化还原稳态相关；综合结果提示细胞周期和染色体过程、免疫炎症信号、脂质和氨基酸代谢三类转录特征。23个肠道氧化应激相关基因中，nrf2显著下调（fold change=0.6741，p=0.0058），cldn受抑制，抗凋亡基因bcl2l1显著上调10.165倍，促凋亡基因ddit3下调（fold change=0.4472），myc、crtc2、irs2、p38显著升高，补体成分c3和趋化因子cxcl10上调。3.6 qPCR验证：肠道屏障基因ocl n呈非显著上升趋势，cldn在PM1.0组显著下调；bcl2l1显著上调、ddit3显著下调；myc、crtc2、irs2、p38显著诱导；促炎基因fos和il17c显著下调，c3显著上调；nrf2 mRNA显著下调，gpx中度升高，gclc和gsr无显著差异。3.7 P. marcusii缓解H₂O₂诱导的原代肠道细胞氧化损伤：以600 μmol/L H₂O₂建立细胞损伤模型，活菌Transwell共培养72 h及30 μg/mL色素粗提物预处理均显著提高氧化应激下细胞活力；两者均恢复SOD、CAT、GSH-PX活性并降低MDA积累。qPCR仅在粗提物处理细胞中开展：CON+H₂O₂组keap-1较CON组升高11.26倍，nrf2和sod降低；无H₂O₂时粗提物使keap-1降低，nrf2、cldn、sod、cat分别上调9.29、1.51、3.76、3.97倍；H₂O₂挑战下粗提物恢复nrf2和sod转录水平。

讨论部分总结：与富含虾青素的H. pluvialis等研究相比，本研究中1.0 g/kg P. marcusii在氧化鱼油应激下提高生长性能；抗氧化酶结果提示其主要抗氧化作用可能更多发生在肠道黏膜局部，而血清MDA变化相对有限。菌群测序结合TEM观察表明，P. marcusii可重塑肠道菌群并减轻肠上皮亚细胞损伤，体外原代细胞试验也支持其保护表型；研究人员认为其可能通过分泌生物活性代谢物或刺激宿主产生内源性抗氧化物质发挥作用。变形菌门富集的作用具有情境依赖性；冻干粉含残存活菌及大量菌体碎片和大分子，不能仅凭Paracoccus序列升高推断定植。免疫相关转录结果显示c3、cxcl10升高而fos、il17c降低，提示免疫信号改变但未出现病理性炎症过度激活；ddit3下降和ocl n上升趋势与TEM所见的细胞器恢复和紧密连接完整相一致，cldn降低可能反映损伤恢复中的代偿性转录。体外色素粗提物使nrf2上调、keap-1下调，而体内肠道nrf2 mRNA下降，构成体内外Keap-1/Nrf2轴转录模式差异这一关键发现；研究人员推测完整肠道多细胞微环境和稳态抗氧化回路导致情境依赖响应，而简化原代细胞系统对色素富集提取物产生直接反应。局限包括缺乏经验证的L. polyactis种属特异性抗体、未能进行蛋白水平验证；未测体内ROS；氧化鱼油挑战仅限最后7 d；仅一个应激后采样时间点；16S rRNA扩增子仅至属水平且不能区分死活菌，不能确认菌株定植。

研究结论翻译：本研究采用体内饲养试验和体外细胞模型，研究P. marcusii对L. polyactis肠道抗氧化反应的影响。日粮补充1.0 g/kg冻干P. marcusii IHA034菌粉可缓解氧化鱼油引起的生长抑制，提高血清和肠道内源性抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-PX）活性，并修复氧化鱼油诱导的肠上皮微绒毛和线粒体损伤。体外细胞试验显示，活菌P. marcusii及其提取物可缓解急性H₂O₂介导的氧化损伤；提取物在细胞水平上调nrf2并抑制keap-1。值得注意的是，体内氧化鱼油饲养模型与体外H₂O₂挑战细胞模型之间观察到不同的Nrf2转录模式，揭示该核心抗氧化通路具有情境依赖性转录特征。观察到的保护效应可能涉及抗氧化反应、肠道形态改善、肠道菌群调节和免疫相关转录改变等多个相互关联过程，而非主要依赖Keap-1/Nrf2通路。总体而言，该工作为P. marcusii作为候选抗氧化饲料添加剂提供了初步机制线索和实证数据，值得进一步研究。