基于骆驼科纳米抗体（VHH）的纳米生物共轭物开发及Bothrops与Crotalus蛇毒检测研究

《Biosensors》：Development of Camelid Nanobody-Based Nanobioconjugates for the Detection of Bothrops and Crotalus Venoms

　　

蛇咬伤中毒仍是重要的全球公共卫生问题，巴西是通报率最高的国家之一，尤其是在北部地区。治疗干预对蛇咬伤病例具有决定性作用，因为早期给予抗蛇毒血清可降低全身和局部表现的严重程度。然而，在缺乏诊断检测的情况下，对导致中毒的蛇种的识别仍局限于临床和流行病学评估。在此背景下，本研究展示了利用由针对响尾蛇和巴西具窍蝮蛇（该国有医学重要性的蛇种）的抗蛇毒VHH（重链抗体可变区，variable domain of heavy chain-only antibodies）组成的纳米生物共轭物（nanobioconjugates）开发蛇咬伤中毒诊断检测方法的潜力。在点印迹（dot blot）试验中，抗Bothrops纳米生物共轭物对Bothrops jararacussu蛇毒表现出可见反应性，最低至10 ng/μL，且在浓度≥50 ng/μL时反应更为稳定。抗Crotalus纳米生物共轭物可检测Crotalus durissus terrificus蛇毒，最低浓度达400 ng/μL，并对另外三个Crotalus亚种蛇毒也表现出反应性。在对照试验中，对所评估的异源蛇毒未观察到交叉反应性。这些结果为基于VHH的纳米生物共轭物用于蛇毒检测的潜在应用提供了初步证据，同时表明在临床应用于前需进一步优化分析灵敏度。

蛇咬伤中毒（snakebite envenoming）被世界卫生组织（WHO）列为优先忽视热带病，每年约270万人受影响，导致8.1万至13.8万人死亡。巴西是全球通报率最高的国家之一，北部和中部地区发病率尤为突出。在该国具有医学重要性的四个蛇属（Bothrops、Crotalus、Micrurus和Lachesis）中，Bothrops属约占67%的通报病例，Crotalus属致死率最高并占8%的病例。目前，蛇咬伤治疗的决策在缺乏特异性诊断检测的情况下主要依赖临床和流行病学评估，而不同蛇属引起的症状相似，尤其在多蛇属共存地区，可妨碍快速准确的诊断。因此，开发快速、特异的蛇毒检测方法对改善治疗结局具有重要意义。基于VHH（重链抗体可变区）抗体高稳定性、高特异性、与纳米材料良好相容性等优点，研究人员旨在开发由抗蛇毒VHH偶联金纳米颗粒（AuNPs）组成的纳米生物共轭物，用于检测Bothrops和Crotalus蛇毒。

研究人员选择了四个前期已鉴定的VHH，即抗Crotalus的KF498604和PZ837026，以及抗Bothrops的KF498607和KC329718。通过异源表达与纯化、AuNPs合成与表征、生物共轭条件优化以及dot blot检测，评估了纳米生物共轭物的反应性和特异性。结果显示，抗Bothrops纳米生物共轭物可识别B. jararacussu蛇毒低至10 ng/μL，抗Crotalus纳米生物共轭物可识别Crotalus durissus terrificus蛇毒低至400 ng/μL，且对异源蛇毒无交叉反应。这些初步证据支持VHH纳米生物共轭物用于蛇毒检测的潜力，但分析灵敏度仍需进一步优化才能进入临床评估。

研究人员采用的主要关键技术方法包括：1) 将靶向蛇毒毒素的VHH基因克隆至pET载体，在E. coli BL21(DE3)或SHuffle? T7 Express菌株中异源表达，并通过固定化金属亲和色谱（IMAC）纯化；2) 采用Turkevich方法合成胶体金纳米颗粒，利用紫外可见光谱和透射电子显微镜（TEM）表征其尺寸、浓度和形貌；3) 通过三步优化确定VHH-AuNPs生物共轭的最佳条件，包括稳定剂丙烯酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯（acrylic acid–NHS-ester）浓度、溶液pH和VHH用量，并估算化学计量比；4) 采用dot blot的夹心法和直接检测法评估纳米生物共轭物对不同蛇毒的反应性，并用Ponceau S染色验证膜上蛋白吸附。所有蛇毒均来自巴西圣保罗州Batatais的Serpentário de Proteínas Bioativas。

**研究结果**：

**3.1 异源表达与VHH纯化**：通过SDS-PAGE分析确认四个VHH均成功表达并纯化，其中KC329718和PZ837026的产量约为每升培养物4.5 mg。

**3.2 VHH反应性评估**：ELISA结果显示，抗Crotalus VHH KF498604和PZ837026可结合C. d. terrificus全毒、crotoxin（CTX）及其CB亚基；抗Bothrops VHH KC329718可结合B. jararacussu全毒和bothropstoxin-II（BthTX-II），而KF498607仅结合全毒。

**3.3 金纳米颗粒表征**：AuNPs在518 nm处有最大吸收峰，估算直径约12 nm，浓度约10.4 nM，TEM确认其为球形形态。

**3.4 VHH与AuNPs生物共轭优化**：通过三步筛选确定最佳稳定剂浓度为100 mM acrylic acid–NHS-ester；最佳pH分别为PZ837026 7.5、KC329718 8.5；最佳VHH用量分别为4 μg和6 μg。计算得到VHH:AuNP的近似化学计量比分别为32:1和67:1。

**3.5 抗Bothrops VHH纳米生物共轭物的检测**：在夹心dot blot中，KC329718纳米生物共轭物可检测B. jararacussu全毒，最低可见浓度为10 ng/μL，在≥50 ng/μL时反应更稳定，且对Lachesis muta和C. d. terrificus全毒无交叉反应。然而，在直接dot blot中，该共轭物仅对B. alternatus和B. bilineatus蛇毒有可见信号，对B. jararacussu无信号，说明捕获抗体的存在对信号放大至关重要。

**3.6 抗Crotalus VHH纳米生物共轭物的检测**：在直接dot blot中，PZ837026纳米生物共轭物可检测C. d. terrificus全毒，最低浓度为400 ng/μL，且对L. muta和B. jararacussu无交叉反应。该共轭物对分离的CB（PLA₂）亚基在200–75 ng/μL范围内有可见反应，但对完整crotoxin无可见反应。此外，该共轭物能识别C. d. collilineatus、C. d. cascavella和C. d. cumanensis三种亚种蛇毒（200 ng/μL），但无法检测C. atrox蛇毒。

**讨论与结论**：讨论部分指出，PZ837026纳米生物共轭物对捕获抗体KF498604的非特异识别提示牛血清白蛋白（BSA）封闭效果可能不充分，未来可考虑使用casein等替代封闭剂。当前检测灵敏度仍高于文献报道的临床相关蛇毒浓度（通常为ng/mL范围），因此需要进一步优化生物共轭策略和分析灵敏度。血清被认为是未来评估中最有可能的临床基质，但还需考察其他样本类型。研究结论翻译如下：尽管本研究中抗Bothrops和抗Crotalus纳米生物共轭物与评估的异源蛇毒未显示交叉反应性，但对捕获抗体（尤其是crotalic蛇毒检测试验中）的识别表明，需要评估替代的生物共轭策略，包括探索替代稳定剂、优化生物共轭参数以及使用BSA以外的封闭剂。虽然夹心dot blot仅对抗Bothrops纳米生物共轭物进行，但直接格式一致证明抗Crotalus纳米生物共轭物的反应性。此外，本研究达到的分析灵敏度仍高于既往研究通常报道的与蛇咬伤诊断和临床评估相关的ng/mL范围蛇毒浓度。因此，需进一步优化所提出的基于VHH的纳米生物共轭物，以提高在临床相关基质中评估前的分析灵敏度。总之，这些发现为VHH在开发用于检测具窍蝮蛇属和响尾蛇属蛇毒的纳米生物共轭物方面的适用性提供了初步证据，同时强调需要进一步研究以优化这些平台的性能。