基于QCL-MIR与LIBS互补光谱及UVE–PLS–ELM非线性化学计量框架的豌豆粉蛋白质与矿物元素快速定量表征

《Biosensors》：Rapid Protein and Mineral Characterization of Pea Flour Using QCL-MIR and LIBS Combined with UVE–PLS–ELM Machine Learning Framework

　　

富蛋白质农业材料的快速定量表征仍具有挑战性，原因在于植物源基质的分子与元素复杂性。本研究考察了基于外腔量子级联激光的中红外光谱（QCL-MIR）与激光诱导击穿光谱（LIBS）作为互补方法，用于预测豌豆粉（Pisum sativum L.）样品中的蛋白质与元素组成。QCL-MIR光谱主要探测分子振动信息，而LIBS通过等离子体产生的原子和离子发射特征直接监测元素组成。为应对两个光谱数据集中的高维性与非线性关系，研究人员实施了结合无信息变量消除（UVE）、偏最小二乘（PLS）回归与极限学习机（ELM）建模的先进化学计量策略。鉴于数据集规模有限（N = 20），预测性能采用浓度分层五折预测策略进行评估。优化的UVE–PLS–ELM方法对两种技术均较传统线性PLS模型提高了预测性能。QCL-MIR光谱在当前数据集内对总蛋白含量表现出强预测性能（R² = 0.97），并通过与样品组成的间接相关性对磷和钾提供了有前景的预测。LIBS对总蛋白含量也表现出强校准与预测能力（R² = 0.93），并对Na、Mg、Ca、Mn和Fe表现出良好预测性能。然而，LIBS性能在浓度极端处下降，尤其是对高浓度元素（K和P）以及Zn和Cu等微量元素。这些结果表明QCL-MIR与LIBS的互补优势，并突显了非线性化学计量方法在当前有限数据集内用于富蛋白质农业材料准确定量组成分析的潜力。

研究背景与目的：植物源材料尤其是豌豆粉等富蛋白豆类基质的营养品质，受蛋白质与矿物组成显著影响。准确测定蛋白质及Mg、P、K、Ca、Mn、Fe、Cu、Zn等必需矿物营养元素，对评价营养价值、监测作物与食品品质以及优化农业和食品生产体系十分重要。近年来植物基蛋白与可持续食品资源需求增加，需要快速、可靠、高通量的分析手段来表征复杂植物基质。传统凯氏消化、电感耦合等离子体发射光谱（ICP-OES）和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）通常准确性高，但样品前处理多、需化学试剂且分析时间较长，限制其用于快速或常规工业应用。近红外（NIR）和中红外（MIR）光谱因快速、少前处理并可提供蛋白质、碳水化合物、脂质等分子信息而受到关注；MIR对蛋白质功能团振动尤其敏感，包括酰胺I（1600–1700 cm^?1）、酰胺II（1500–1600 cm^?1）和酰胺III（1200–1350 cm^?1）区域。但植物样品化学复杂且异质，蛋白质、淀粉、纤维、脂质和水分光谱重叠，直接定量困难，需先进化学计量框架。基于外腔量子级联激光器（EC-QCL）的MIR仪器具有较高光谱功率密度和信噪比，适合强吸收或散射样品，但其用于复杂植物源基质尤其富蛋白豆类面粉仍有限。激光诱导击穿光谱（LIBS）可多元素检测、少前处理、快速采集，但基质效应、样品异质性、自吸收、大气氮氧干扰及非线性等离子体–样品作用会影响重现性和预测，需要化学计量方法从高维LIBS光谱中提取信息。偏最小二乘（PLS）回归可处理高度共线高维数据，但线性方法对异质植物材料复杂非线性关系有限；极限学习机（ELM）可快速建模非线性关系，无信息变量消除（UVE）可剔除噪声和非信息变量。已有小样本光谱研究仍需严格验证。尽管兴趣增长，将先进MIR或LIBS结合非线性化学计量用于豌豆粉这类复杂植物蛋白基质定量表征的研究较少，二者对蛋白质和多矿物同时预测的潜力尚未充分探索。因此，本研究比较评价EC-QCL MIR反射光谱与LIBS结合统一UVE–PLS–ELM建模框架，在有限光谱数据集中快速预测豌豆粉蛋白质和矿物组成，并考察非线性建模能否改善小样本预测性能，利用分子与元素互补信息。

研究人员开展的研究、结论与意义：研究使用20个基因型豌豆粉样品，参考矿物浓度由ICP-MS测定并取三重复均值，总蛋白由氮分析仪测定并以wt%表示；比较QCL-MIR与LIBS，采用浓度分层五折预测策略评估UVE–PLS–ELM。结果表明，优化的UVE–PLS–ELM较传统线性PLS改善两种技术的预测性能；QCL-MIR对总蛋白表现出强预测性能（R² = 0.97），并通过与样品组成的间接相关性对P和K提供有前景预测；LIBS对总蛋白（R² = 0.93）及Na、Mg、Ca、Mn、Fe表现良好，但在浓度极端处性能下降，尤其高浓度K、P及Zn、Cu等微量元素。该研究意义在于展示QCL-MIR与LIBS的互补优势，并提示非线性化学计量策略在当前有限数据集内用于富蛋白农业材料准确组成分析的潜力；但模型稳健性和泛化性仍需更大、更多样数据集验证。

关键技术方法：20个豌豆基因型面粉样品，其种植与研磨见既往发表，参考矿物由University of Saskatchewan, Canada的ICP-MS三重复均值确定，蛋白由氮分析仪测定。QCL-MIR反射系统（EC-QCL，745–1920 cm^?1）以10×10网格映射，KBr归一化；LIBS用1064 nm Nd:YAG激光（约35 mJ，5 Hz），Ar气氛，10位置×20脉冲累积。MIR预处理为Savitzky–Golay平滑、?log(R)、标准正态变量（SNV）和0.75阶分数阶导数（FOD）；LIBS为基线校正和SNV。建模采用UVE变量选择、PLS潜变量提取和ELM非线性建模，并以浓度分层五折预测及Y随机化评估。

研究结果：
3.1 光谱特征与复杂性：MIR测量先于LIBS以保持表面完整；MIR采用10×10映射，LIBS采用10位置×20脉冲累积。
3.1.1 MIR光谱：代表性MIR谱呈宽重叠带，反射模式受散射和粒径影响，FOD改善重叠特征分辨并兼顾噪声抑制。
3.1.2 LIBS光谱：LIBS谱显示大量窄原子和离子发射线，提供Na、Mg、Ca、Fe、Mn、K等元素指纹；MIR与LIBS互补，前者提供分子信息，后者提供元素信息。
3.2 基于MIR的定量分析：以PLS降维并按浓度分层五折评估。
3.2.1 MIR光谱的PLS预测：常规PLS对蛋白RMSE = 2.77%、R² = 0.75、RPD = 2.05；对P和K较低，R²分别为0.56和0.44，RPD分别为1.54和1.37，示线性建模不足。
3.2.2 UVE对MIR–PLS模型的影响：UVE使蛋白R²由0.75升至0.83、RMSE由2.77%降至2.29%；K的R²由0.44升至0.64、RMSE由1074.57降至868.09 ppm；P的R²由0.56升至0.60、RMSE由520.87降至491.68 ppm，示冗余变量影响。
3.2.3 UVE–PLS–ELM增强MIR预测：蛋白R² = 0.97、RMSE = 0.96%、RPD = 5.92；P为RMSE = 251.03 ppm、R² = 0.90、RPD = 3.19；K为RMSE = 601.46 ppm、R² = 0.82、RPD = 2.45；Na、Mg、Ca、Zn、Cu、Mn、Fe的R² ≤ 0.37、RPD ≤ 1.25，预测差。原文将P、K的可预测性部分解释为与植酸复合物、浓度水平及基质协变有关，微量营养低浓度贡献弱；非线性模型优于线性模型。
3.2.4 MIR最重要变量：代表性子集中UVE保留变量及第一潜变量贡献显示蛋白在酰胺区贡献最大，800–1200 cm^?1存在C–O/C–O–C与P–O/P–O–C重叠，不能唯一归属；P、K的MIR预测为组成协变而非直接响应，P–K强相关且控制蛋白后基本不变，弱化蛋白旁观解释，但未证明MIR谱带对P、K化学特异。由于UVE在各折单独进行，代表性子集不等同于跨折稳定预测空间。
3.3 基于LIBS的定量分析：LIBS直接探测等离子体原子和离子发射。
3.3.1 LIBS单变量分析：Fe表现最好（R² = 0.89，RPD = 3.19）；Na、Ca中等，R²约0.70、RPD约2；Zn、Cu因低浓度和窄范围弱，P因弱光学跃迁和紫外灵敏度受限，K受自吸收影响；蛋白基于氮线预测差（R² = 0.34，RPD = 1.26），大气氮干扰明显，单峰校准不足。
3.3.2 LIBS光谱的PLS预测：蛋白RMSE = 3.38%、R² = 0.63、RPD = 1.70；Na较好、Fe较有利，Mg、Ca、Mn有限，示线性多变量模型不足。
3.3.3 UVE对LIBS–PLS模型的影响：蛋白R²由0.63升至0.74、RPD由1.70升至2.05；Na由0.75升至0.91，Ca由0.37升至0.53，Mn由0.29升至0.70，Fe由0.73升至0.82。
3.3.4 UVE–PLS–ELM增强LIBS预测：蛋白R² = 0.93、RMSE = 1.41%、RPD = 4.02；Na为R² = 0.95、RMSE = 14.42 ppm、RPD = 4.50；Fe为R² = 0.96、RMSE = 4.91 ppm、RPD = 5.13；Mg为R² = 0.89、RMSE = 67.27 ppm、RPD = 3.09；Ca为R² = 0.83、RMSE = 87.93 ppm、RPD = 2.49；Mn为R² = 0.85、RMSE = 0.98 ppm、RPD = 2.65；Cu、Zn、P、K仍不理想，Zn、Cu弱发射且接近检出限，K受自吸收影响。
3.3.5 LIBS最重要变量：代表性子集中变量分布广；蛋白预测涉及Mg、Ca、Na、K及C、H、O、Ar和背景变量，744 nm附近氮线未占主导，可能受大气干扰影响；Na由589.0和589.6 nm的Na I线主导；Mg涉及C、Mg、Ca、Na、K、Ar，原文解释为Mg²⁺与植酸等基质组分关联较Na⁺复杂。蛋白与单一矿物相关均未达p < 0.05，最大绝对相关为Cu（r = 0.429）、Na（r = ?0.424）、Mg（r = 0.414）、Ca（r = 0.365），不支持强单一关联，但不排除联合矿物和基质协变。
3.4 预测能力：
3.4.1 五折预测评估：合并折外预测后，MIR蛋白RMSE = 0.96%、R² = 0.97、RPD = 5.92，P为R² = 0.90、RPD = 3.19，K为R² = 0.82、RPD = 2.45；LIBS蛋白RMSE = 1.41%、R² = 0.93、RPD = 4.02，Na、Mg、Ca、Mn、Fe良好。蛋白预测配对bootstrap 50000次重采样，RMSE的95% BCa置信区间MIR为0.731–1.241%、LIBS为1.132–1.710%，R²置信区间分别为0.950–0.981和0.880–0.970，区间重叠，不能判定一种技术优于另一种。单一浓度分层划分不能量化对替代划分的敏感性，bootstrap仅条件于所选划分。
3.4.2 Y随机化验证：约1000次置换后，随机LIBS模型平均RMSE = 4.54%、R² = 0.33、RPD = 1.38；随机MIR模型RMSE = 4.86%、R² = 0.23、RPD = 1.31；性能显著下降，置换p值LIBS约0.004、MIR约0.003，示预测能力不太可能仅来自偶然相关。
3.5 MIR与LIBS比较评价：MIR对蛋白预测最好，UVE选中酰胺带及基质相关吸收，依赖复杂多变量相关；LIBS蛋白预测也强，可能通过元素、基质和等离子体相关模式间接捕获蛋白信息，其可转移性依赖蛋白–矿物协变关系稳定性。MIR对P、K通过植酸和蛋白相关分子环境间接预测；LIBS对Na、Mg、Ca、Mn、Fe更优。LIBS局限包括P弱跃迁和深紫外灵敏度、K自吸收、Cu和Zn弱发射及小样本限制。由线性PLS转为UVE–PLS–ELM显著改善，示异质植物源基质存在非线性光谱–化学关系。
3.6 应用前景：当前数据集显示有限校准数据下QCL-MIR与LIBS结合非线性化学计量的潜力，但稳健性和泛化性待更大更多样数据验证。QCL-MIR和LIBS紧凑，适合未来便携和农场检测，减少中心实验室依赖。豌豆粉与扁豆、蚕豆、鹰嘴豆组成相似，可作未来验证候选；大豆和羽扇豆组成差异更大，需专用校准。当前样品未系统代表栽培种、地理来源、年份或加工条件，稳健性待独立大群体验证；其他豆类应用为需物种特异数据和验证的前瞻扩展。

讨论部分总结：MIR与LIBS分别提供分子和元素信息，具有互补性；MIR在蛋白预测上最强并可间接预测P、K，LIBS在Na、Mg、Ca、Mn、Fe等元素上更有优势；UVE–PLS–ELM较线性PLS改善预测，提示非线性关系；但样本量小、浓度极端和痕量元素限制明显，便携应用与跨豆类扩展仍需更大独立数据验证。

研究结论部分翻译：本研究证明将基于QCL的MIR光谱与LIBS结合先进化学计量建模，用于快速表征复杂豌豆粉基质具有强潜力。结果表明，QCL-MIR光谱在当前数据集内对总蛋白含量表现出强预测性能，并通过与有机基质分子组成的间接关联，对P和K等选定常量元素提供有前景估计。同时，尽管样本量有限（N = 20），LIBS在所研究样品集内对若干必需矿物提供良好预测性能；非线性化学计量建模后，对Na、Mg、Ca、Fe和Mn获得强预测性能。然而，在浓度极端处实现预测准确性仍较困难，尤其是高浓度常量营养元素P和K，以及Zn和Cu等微量元素。结果进一步提示，LIBS可为总蛋白含量提供有用预测信息，蛋白相关信息间接反映在复杂等离子体发射行为和基质依赖光谱响应中。本研究主要成果之一是通过实施UVE–PLS–ELM混合框架提高了预测性能，该框架结合变量选择、潜变量提取和非线性建模。与传统线性PLS模型相比，集成方法对MIR和LIBS数据集均改善预测性能，提示非线性光谱–化学关系有助于这些复杂基质的表征。浓度分层五折预测策略使20个样品各被预测一次且排除于相应模型开发集之外，提供了基于合并折外预测的评估。此外，Y随机化导致预测性能显著下降，表明观察到的模型性能不太可能仅由偶然相关产生。然而，鉴于样本量有限，需使用更大更多样数据集进一步验证所提模型的稳健性和泛化性。总体而言，本研究证明基于QCL的MIR光谱与LIBS在豆类源材料营养表征中的互补优势，并突显先进非线性化学计量策略在仅有有限校准数据集时提取有意义组成信息的价值。未来工作将聚焦扩展数据集，纳入更多样品和更大组成多样性及环境，从而增强所提框架的稳健性和泛化性。此外，将研究结合LIBS与QCL-MIR测量的数据融合策略，以进一步提高预测性能并利用两种光谱技术提供的互补信息。