基于AhR-GFP救援细胞的裂解液微尺度热泳（MST）无纯化表征配体依赖性芳香烃受体（AhR）响应

《Biosensors》：A Lysate-Based Microscale Thermophoresis Assay for the Analysis of Ligand-Dependent Aryl Hydrocarbon Receptor Responses

　　

芳香烃受体（AhR）是一种配体激活的转录因子，参与外源物代谢、免疫调节和细胞稳态。AhR-配体相互作用传统上使用放射性配体结合试验研究，最近则通过微尺度热泳（MST）应用于纯化的重组AhR-芳香烃受体核转位蛋白（AhR-ARNT）复合物进行研究。尽管这些方法能够表征配体结合，但它们需要放射性标记配体或纯化的重组受体系统，因此不能完全重现细胞中受体周围的分子复杂性。在此，研究人员开发了一种基于裂解液的MST试验，以在无需受体纯化的情况下表征细胞来源分子环境中的配体依赖性AhR响应。在AHR敲除背景中生成AhR-绿色荧光蛋白（AhR-GFP）救援细胞系，使荧光标记的AhR同时作为靶蛋白和内源性荧光示踪剂。功能验证证实，AhR-GFP的配体诱导核转位和细胞色素P450家族1亚家族A成员1（CYP1A1）诱导具有与野生型细胞相当的敏感性。直接在细胞裂解液中进行MST测量，揭示了对AhR激动剂6-formylindolo[3,2-b]carbazole（FICZ）、2-(4-amino-3-methylphenyl)-5-fluorobenzothiazole（5F 203）、β-naphthoflavone和1-hydroxyphenazine，以及拮抗剂CH223191和BAY 2416964的浓度依赖性响应，使得能够确定表观半数有效浓度（EC₅₀^app）。总之，这些发现建立了一种无纯化的MST试验，用于在复杂的细胞来源分子环境中探测配体依赖性AhR响应。

研究背景与问题：芳香烃受体（AhR）是一种配体依赖性转录因子，属于碱性螺旋–环–螺旋Per–Arnt–Sim家族，参与外源物代谢、免疫应答、细胞分化和肿瘤生物学等过程，并可被结构多样的外源性和内源性配体激活。常用细胞功能试验（如报告基因、CYP1A1诱导或AhR靶基因转录读出）能提供受体激活和信号转导信息，但不能作为配体-受体直接结合证据，因为响应可受化合物摄取、胞内代谢、稳定性或脱靶效应影响。传统AhR配体结合研究主要依赖[³H]-2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin（TCDD）放射配体竞争试验和含内源AhR的胞质提取物，但需要放射性材料和多步分离，不适合常规筛选。近年来，微尺度热泳（MST）可用于溶液中的生物分子相互作用分析；Stinn et al. 已用纯化重组人AhR-ARNT复合物通过MST直接表征AhR-配体相互作用，提供非放射性替代方案，但依赖重组蛋白生产和纯化，且将AhR从细胞内的多蛋白胞质复合物中移出。细胞内AhR与热休克蛋白90（HSP90）、X-associated protein 2（XAP2）和p23等分子伴侣及辅因子形成复合物，这些相互作用在纯化重组系统中缺失或仅部分重现，可能影响配体可及性和受体行为。因此，需要建立无纯化、可在细胞来源复杂分子环境中检测配体依赖性AhR响应的分析方法。研究人员据此建立基于裂解液的MST试验，使AhR-GFP同时作为靶蛋白和内源性荧光示踪剂，并在AHR敲除背景中建立AhR-GFP救援细胞，以检测结构及药理多样的一组已知AhR激动剂、拮抗剂和非经典调节剂。该研究得出：无需受体纯化即可在AhR-GFP裂解液中检测多种配体依赖性热泳响应并估计表观半数有效浓度（EC₅₀^app），但该信号并非普适的配体结合、受体占据或亲和力测量，而是反映复杂裂解液基质中AhR-GFP热泳行为的整合响应；其意义在于为功能细胞试验与纯化受体结合测量之间提供互补分析策略。

关键技术方法概述（不超过250字）：研究采用美国典型培养物保藏中心（ATCC）来源的AU565人乳腺腺癌细胞，经CRISPR/Cas9建立AHR敲除（AHR-KO/ΔAHR）AU565单克隆，并稳定转染PiggyBac-AhR-GFP表达载体建立AhR-GFP救援细胞。主要方法包括：乙氧基试卤灵-O-脱乙基酶（EROD）试验评估CYP1A1依赖性酶活性；免疫细胞化学及核/质荧光强度比定量评估配体诱导AhR核转位；以AhR-GFP救援细胞制备裂解液，在无需受体纯化条件下进行MST检测，记录归一化荧光变化（ΔF_norm），并用非线性回归估计EC₅₀^app；以ΔAHR裂解液补充游离GFP作为AhR依赖性对照。

研究结果：
3.1 Validation of the AhR-GFP Rescue Model：通过荧光显微镜、免疫细胞化学和EROD试验验证AhR-GFP救援模型。AhR-GFP救援细胞显示GFP荧光，而野生型（WT）和ΔAHR细胞无GFP荧光；FICZ诱导AhR-GFP明显向核内重分布，低至1 nM即可显著提高核/质荧光比。免疫细胞化学显示FICZ促进WT和AhR-GFP救援细胞中AhR核积累，ΔAHR细胞无相应响应。EROD试验显示FICZ在WT细胞诱导明显活性，AHR缺失导致活性近乎完全丧失，AhR-GFP重新表达恢复FICZ诱导的EROD响应且活性高于WT细胞。结论：GFP标签未阻止配体诱导核转位和下游CYP1A1依赖性酶活性，支持AhR-GFP同时作为功能受体和MST内在荧光示踪剂。
3.2 A Lysate-Based MST Assay Detects Ligand-Dependent Responses to Reference AhR Agonists in AhR-GFP-Containing Lysates：通过AhR-GFP裂解液MST检测参考激动剂。5F 203在AhR-GFP裂解液中产生明显浓度依赖性MST响应，EC₅₀^app为36 ± 9 μM（R² = 0.87）；而在缺乏AhR-GFP并补充40 nM GFP的ΔAHR裂解液中未见可重复浓度依赖性响应，非线性回归未得到有意义的EC₅₀^app（R² = 0.005），支持5F 203响应与AhR-GFP存在相关，但不确立直接受体–配体结合或排除其他裂解液成分的间接影响。FICZ产生可重复浓度依赖性响应，EC₅₀^app为140 ± 60 nM（R² = 0.93）；β-naphthoflavone的EC₅₀^app为5 ± 2 μM（R² = 0.85）；1-hydroxyphenazine（1-HP）的EC₅₀^app为23 ± 5 μM（R² = 0.87）。结论：结构多样的AhR激动剂可在AhR-GFP裂解液中产生纳摩尔至微摩尔范围的浓度依赖性MST响应，且5F 203在AHR-KO裂解液中无相应响应，支持在所试条件下该响应依赖AhR-GFP；该试验证明无需受体纯化即可在复杂细胞来源分子环境中检测配体依赖性响应。
3.3 Detection of AhR Antagonists by Lysate-Based MST：通过AhR-GFP裂解液MST检测AhR拮抗剂。CH223191产生浓度依赖性响应，EC₅₀^app为1.6 ± 0.8 μM（R² = 0.81）；SR1在测试浓度范围内引起MST信号变化，但响应曲线未获得稳定非线性回归拟合，无法可靠估计EC₅₀^app；BAY 2416964产生可重复浓度依赖性响应，EC₅₀^app为6 ± 1 μM（R² = 0.93），但其自发荧光和高浓度溶解度限制妨碍观察明确的上部响应平台。结论：该裂解液MST方法可检测结构多样的AhR拮抗剂引起的浓度依赖性AhR-GFP响应，但SR1的可变响应表明已知AhR配体并不必然产生可定量的浓度依赖性MST响应。
3.4 Evaluation of Terpenoid-Derived Compounds by Lysate-Based MST：通过AhR-GFP裂解液MST评估萜类衍生化合物。cis-jasmone产生可重复浓度依赖性响应，EC₅₀^app为60 ± 20 μM（R² = 0.76），提示其报告的AhR信号调节活性伴随AhR-GFP热泳行为的浓度依赖性变化，并提示该试验可能检测经典正构激动剂和拮抗剂之外的非经典AhR调节剂响应。(R)-(+)-limonene引起MST信号变化但响应可变且无稳定非线性回归拟合，无法可靠估计EC₅₀^app；(S)-(+)-carvone未产生可重复浓度依赖性MST响应，无法可靠估计EC₅₀^app。结论：部分非经典AhR调节剂可在AhR-GFP裂解液中产生浓度依赖性MST响应，另一些在该试验条件下不产生可定量响应；已知调节AhR信号并不必然转化为可测MST响应，缺乏可重复MST响应不应解释为化合物不调节AhR，该试验应视为检测调节剂依赖性AhR-GFP热泳行为变化的概念验证方法，而非AhR配体结合、受体占据或结合亲和力的普适测量。

讨论总结：该研究讨论强调，裂解液中的配体依赖性热泳变化不应解释为直接受体–配体结合测量，而是反映标记蛋白行为及其复杂分子环境贡献的整合热泳响应。EC₅₀^app与纯化重组AhR-ARNT复合物测得的平衡解离常数（K_d）不等价：前者是在复杂裂解液基质中描述配体依赖性热泳变化的经验参数，后者是在限定条件下对纯化复合物配体结合的定量。FICZ的EC₅₀^app与Stinn et al. 报道的K_d数量级相近，而1-HP和CH223191的响应浓度相对其对应K_d较高，这种差异不应解释为结合亲和力变化，而应归因于两种方法测量不同实验参数和不同分子条件。5F 203响应方向与多数化合物相反，其来源未解析，不能归于特定分子机制；虽然仪器质量控制未发现浓度依赖性荧光异常或聚集相关信号，且最高测试浓度低于已知溶解度限度，但由于未用正交分析方法独立评估聚集和沉淀，不能排除其潜在贡献。SR1虽已有直接结合AhR并拮抗其活性的报道，但未产生可重复浓度依赖性MST响应，说明已知受体结合本身不足以预测化合物在AhR-GFP裂解液中是否产生可定量MST响应。carvone缺乏可定量MST响应不应解释为其不调节AhR；其非竞争性拮抗机制可能不产生足够大或一致的热泳变化。总体而言，裂解液MST信号可受化合物依赖性荧光、配体可及性、AhR-GFP理化性质变化、内源裂解液成分及其他基质依赖效应影响，需进一步研究以界定局限性和适用范围。

研究结论翻译：这项概念验证研究证明了使用AhR-GFP同时作为靶蛋白和内源性荧光示踪剂直接在细胞裂解液中进行MST测量的可行性和相关性。AhR-GFP救援模型保留了经典AhR信号转导的关键特征，包括配体诱导核转位和下游CYP1A1依赖性酶活性，支持其用于基于裂解液的MST分析。使用该方法，无需受体纯化或外部荧光标记即可检测结构及药理多样的AhR激动剂、拮抗剂和非经典调节剂的可重复浓度依赖性响应。使用该方法获得的EC₅₀^app值不能直接等同于使用纯化重组AhR-ARNT复合物测定的K_d值，因为这些参数描述根本不同的实验测量。更确切地说，基于裂解液的系统通过监测细胞来源裂解液基质中AhR-GFP热泳行为的配体依赖性变化提供互补信息。所试化合物之间观察到的差异响应，包括某些已知AhR调节剂缺乏可定量浓度依赖性响应，进一步表明基于裂解液的MST信号不是配体结合或受体占据的普适测量，并可能受AhR-GFP分子背景影响。观察到的响应可能受化合物依赖性荧光、配体可及性、AhR-GFP理化性质变化、内源裂解液成分及其他基质依赖效应影响。通过将AhR-GFP维持在细胞来源裂解液基质中，本方法为研究AhR药理学提供互补框架，尽管当前工作流程需要生成足够的AhR-GFP表达细胞材料用于裂解液制备。展望未来，进一步优化该方法并使用细胞裂解液可使后续研究考察先前药理学或环境刺激暴露如何影响AhR对后续配体刺激的响应。