动态流离体大鼠长骨缺损模型的建立与表征：骨-生物材料相互作用研究平台

《Journal of Functional Biomaterials》：Establishment and Characterization of a Dynamic-Flow Ex Vivo Rat Long-Bone Defect Model for Bone–Biomaterial Interaction Studies

　　

摘要：离体骨培养模型保留了天然骨三维微环境的某些特征，可为生物材料筛选提供中间平台。然而，动态流全骨缺损模型在骨-生物材料相互作用时间进程评估中的应用仍缺乏充分表征。研究人员建立了一种动态流离体大鼠长骨缺损模型，并评估了其维持细胞活力及检测生物材料相关重塑反应的能力。以生物学副产品获取的长骨经标准化干骺端缺损处理，缺损部位或不予处理，或填充可注射骨水泥。外植体在连续灌注条件下维持培养21天。第21天时，通过Calcein AM/碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色定性评估存活细胞和膜受损细胞的存在；在第7、14和21天评估组织形态、矿化骨和总骨化组织比例以及TRAP阳性破骨细胞数量。动态流培养21天后，成像区域仍可检测到Calcein阳性细胞，且两组矿化骨在整个培养期间均得以保留。与未处理缺损相比，骨水泥处理缺损的矿化组织比例更高(p < 0.001)，总骨化组织比例也更高(p < 0.01)，而培养时间对这两个组织比例终点均无显著影响。骨水泥处理缺损的TRAP阳性破骨细胞数量也更高(p = 0.004)，显著的组别×时间交互作用(p = 0.022)表明该差异取决于培养时长。研究结果证明了使用动态流全骨缺损模型在离体条件下研究骨-生物材料相互作用的可行性。该模型可作为体内评价前骨-生物材料相互作用研究的中间实验平台。

研究背景、现存问题与研究目的

骨组织研究通常采用体内动物模型或体外细胞培养两种途径。二维(two-dimensional, 2D)细胞培养无法再现活骨中的三维(three-dimensional, 3D)结构，细胞间及细胞-基质相互作用难以在人工环境中重建，其生物力学测试和形态完整性也受到质疑。体内动物模型虽可提供完整生理环境，但存在伦理争议、成本高、个体差异大、需专门设施和培训人员等局限。器官芯片技术目前主要面向肺、肝、肾、心、肠等器官，骨芯片应用相对有限。全骨器官培养(whole-bone organ culture, WBOC)作为新兴工具可保留骨的3D组织和细胞多样性，符合替代、减少、优化(3Rs)原则。既往离体研究多采用分离的骨标本(如小梁骨核心、股骨头)而非完整骨骼结构，缺乏将标准化缺损、连续介质循环、生物材料植入和时间进程评估整合为一体的培养配置。因此，研究人员旨在建立并表征一种利用饲养动物副产品获取的完整大鼠长骨构建WBOC模型，以避免为实验专门处死动物，并评估其对骨水泥这一临床相关生物材料的局部组织反应检测能力。

研究人员开展的研究及结论

研究人员在大鼠股骨远端和胫骨近端干骺端创建标准化1 mm直径、2 mm深钻孔缺损，将缺损分为未处理对照组和可注射磷酸钙骨水泥填充组，在连续灌注条件下培养至21天，并在第7、14和21天进行组织学和形态计量学分析。结果表明：培养21天后骨构建体仍存在广泛分布的活细胞；骨水泥组矿化组织和总骨化组织比例显著高于对照组；骨水泥组抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)阳性破骨细胞数量在培养后期显著高于对照组。该模型可作为体内评价前筛选生物材料的中间实验平台，有助于减少专用动物实验数量。

关键技术方法

样本来源于机构动物设施中因与研究无关原因处死的4周龄雌/雄大鼠，双侧股骨和胫骨作为生物学副产品无菌采集。在干骺端创建标准化钻孔缺损。采用改良六孔板动态流培养系统，蠕动泵以500 μL/min连续循环含10%胎牛血清和1%庆大霉素/两性霉素B的DMEM培养基。第21天以Calcein AM/碘化丙啶(PI)染色定性评估细胞活力。组织学分析采用苏木精-伊红(H&E)、Movat五色、Safranin O/Fast Green和TRAP染色；使用ImageJ/Fiji的Trainable Weka Segmentation插件进行组织分割与形态计量，以组别和培养时间为固定因素进行双因素方差分析(two-way ANOVA)。

研究结果

3.1 细胞活力的维持
第21天Calcein AM/碘化丙啶(PI)荧光成像显示，骨构建体广泛区域存在Calcein阳性活细胞；高倍镜下可见骨基质内活细胞呈异质性但广泛的分布，且钻孔及骨水泥填充区域周围出现强烈荧光信号聚集，表明缺损附近和骨水泥界面处存在代谢活跃、膜完整的细胞，细胞活力不局限于外植体周边区域。

3.2 动态流全骨缺损模型中组织反应的时间进程组织学表征
H&E染色显示缺损区域从第7天至第21天逐渐缩小、边界逐渐模糊，提示培养期间发生组织渐进性填充和重塑。Movat五色染色及定量分析显示，骨水泥组矿化骨比例显著高于对照组(p < 0.001，partial η² = 0.54)，培养时间无显著效应(p = 0.25)，组别×时间交互作用不显著(p = 0.78)。Safranin O/Fast Green染色显示骨水泥组总骨化组织比例显著更高(p < 0.01)，培养时间和交互作用均不显著，且缺损区域未观察到明显软骨组织形成。TRAP染色显示破骨细胞数量受组别(p = 0.004)和培养时间(p < 0.01)显著影响，存在显著交互作用(p = 0.022)；第7天两组间无差异，第14天和第21天骨水泥组显著高于对照组。

讨论与结论

讨论部分指出，本研究将完整长骨缺损、连续灌注和时间进程组织学评估整合为标准化工作流程，区别于既往使用分离骨标本的离体模型。连续介质循环可能有助于维持厚组织三维外植体的营养和氧气供应。骨水泥组矿化/骨化组织比例更高且破骨细胞数量在后期增加，提示生物材料相关组织反应而非单纯被动填充。局限包括股骨与胫骨的解剖差异、大鼠与人体骨的种属差异、缺乏静态培养对照及幼龄动物骨骼发育活跃等。研究结论：本研究建立的动态流离体全骨缺损模型可保存可检测的细胞活力和组织结构，能够识别骨水泥相关的矿化/骨化组织比例和TRAP阳性破骨细胞数量差异；骨水泥组与对照组的组织成分差异未随培养时间增加而扩大，表明生物材料相关差异被维持，而破骨细胞数量随时间增加表明细胞活性持续变化。该模型可作为受控离体条件下研究局部骨-生物材料相互作用的概念验证平台。