《Foods》：A Duplex Proofman-LMTIA Assay for Rapid Detection of Shrimp, Crab, and Fish Allergens in Food Products
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摘要：海鲜过敏是全球重大的食品安全问题，其中鱼、虾和蟹是重要的致敏源。本研究将梯级熔解温度等温扩增（LMTIA）与校读酶介导探针剪切（Proofman）技术相结合，建立了一种用于快速同步检测甲壳类（虾/蟹）和鱼类过敏原的双重检测方法。研究人员从虾和蟹的原肌球蛋
摘要：海鲜过敏是全球重大的食品安全问题，其中鱼、虾和蟹是重要的致敏源。本研究将梯级熔解温度等温扩增（LMTIA）与校读酶介导探针剪切（Proofman）技术相结合，建立了一种用于快速同步检测甲壳类（虾/蟹）和鱼类过敏原的双重检测方法。研究人员从虾和蟹的原肌球蛋白基因以及鱼类线粒体16S rDNA基因的保守区域设计了组特异性引物和Proofman探针。优化后的反应温度为61°C，扩增在30分钟内完成。该检测方法表现出高特异性，与鱿鱼、贝类以及常见的畜禽肉类无交叉反应。纯基因组DNA的检出限为虾和鱼类5 pg/μL，蟹类10 pg/μL。在模拟肉混合物中，虾的检出限为4%（w/w），鱼类和蟹类为8%（w/w）。对12种市售加工食品的检测结果与其标签声明一致。与中国出入境检验检疫行业标准中规定的参考环介导等温扩增（LAMP）方法相比，该方法在保持高灵敏度的同时，实现了双重检测并减少了非特异性扩增，显示出其在食品安全快速检测中的应用潜力。
研究背景与意义
海鲜过敏是全球范围内日益严峻的公共卫生挑战。虾、蟹和鱼类作为广泛消费的动物蛋白来源，同时也是诱发免疫球蛋白E（IgE）介导过敏反应的主要致敏原，其临床表现可从轻微的皮肤刺激到危及生命的过敏性休克。随着食品加工业供应链的复杂化，交叉污染风险增加，亟需开发快速、灵敏、特异且简便的过敏原检测方法。现有检测技术各有局限：基于蛋白质的方法如酶联免疫吸附测定（ELISA）和侧流免疫层析（LFIA）易受加工过程中蛋白质变性影响导致假阴性；质谱法（MS）虽精确但设备昂贵、操作复杂；基于DNA的方法如聚合酶链式反应（PCR）依赖热循环仪，不便于现场检测；环介导等温扩增（LAMP）虽可实现等温扩增，但引物设计复杂且易产生非特异性扩增。因此，本研究旨在整合梯级熔解温度等温扩增（LMTIA）与校读酶介导探针剪切（Proofman）技术，建立一种能够同步、快速检测甲壳类（虾/蟹）和鱼类过敏原的双重检测体系，以克服上述方法的不足。
研究方法概述
研究人员首先从NCBI GenBank数据库获取多种虾、蟹和鱼类的靶基因序列，利用DNAMAN软件进行多序列比对以确定保守区域，并使用Oligo 7软件筛选具有梯级熔解温度特征的候选靶区。随后，通过Primer 3 Plus在线工具设计针对虾/蟹和鱼类的LMTIA引物，并基于环引物序列分别设计带有Cy5（虾/蟹特异性）和FAM（鱼类特异性）荧光标记的Proofman探针。所有引物和探针由安徽通用生物科技有限公司合成。实验所用样品包括30种食品样本（购自中国许昌胖东来超市）和12种市售加工产品（购自线上超市）。基因组DNA提取采用天根生化科技（北京）有限公司的动物基因组DNA提取试剂盒，并使用NanoDrop One分光光度计和Qubit 4荧光计进行质量评估。双重Proofman-LMTIA反应体系包含LMTIA预混缓冲液、两组特异性引物、Bst DNA聚合酶、相应Proofman探针及DNA模板，反应总体积为10 μL。扩增和实时荧光采集在天隆科技Gentier 96E实时荧光PCR系统上进行。同时，依据中国出入境检验检疫行业标准建立LAMP方法作为参考对照。
研究结果
3.1 双重Proofman-LMTIA反应温度的优化
通过在59–62°C范围内进行温度梯度实验，综合比较循环阈值（Ct值）、荧光强度和扩增曲线一致性，确定61°C为最优反应温度。在此温度下，鱼类基因组DNA约在第10个荧光采集周期即可产生可检测的扩增信号。
3.2 双重Proofman-LMTIA的特异性评价
利用来自4种虾、4种蟹、10种鱼类以及非靶标物种（包括蛤蜊、扇贝、牡蛎、贻贝、鲍鱼、蛏子、鱿鱼、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉和鹅肉）的基因组DNA进行测试。结果显示，所有非靶标样本及无模板对照均无扩增信号。所有虾、蟹和鱼类样本均产生清晰扩增信号，且虾和蟹的DNA仅在甲壳类特异的Cy5通道产生信号，鱼类DNA仅在鱼类特异的FAM通道产生信号，两通道间无交叉反应。
3.3 双重Proofman-LMTIA的重复性评估
对虾、蟹和鱼类基因组DNA分别进行10次平行反应。Ct值的相对标准偏差（RSD）分别为虾6.1%、蟹5.2%、鱼类3.8%，表明该方法具有良好的重复性和稳定性。
3.4 双重Proofman-LMTIA的灵敏度评价
对系列稀释的基因组DNA进行检测。虾和鱼类DNA在5 pg/μL及以上浓度均产生阳性信号，蟹DNA在10 pg/μL及以上浓度产生阳性信号。在预设Ct<35为阳性判定的标准下，虾和鱼类的最低可检浓度为5 pg/μL，蟹为10 pg/μL。
3.5 双重Proofman-LMTIA在模拟肉混合物中的检出限
将虾、蟹和鱼类肉糜分别与鸡肉混合制备不同质量分数的模拟肉混合物。虾在4%（w/w）及以上质量分数可检出阳性信号，而鱼类和蟹在8%（w/w）及以上质量分数可检出阳性信号。因此，虾的最低检出质量分数为4%（w/w），鱼类和蟹为8%（w/w）。
3.6 市售食品中过敏原的检测
对12种标注含虾、蟹或鱼类成分的市售加工产品进行检测。虾丸、虾酱、虾皮和虾酱在甲壳类特异性Cy5通道呈阳性；鱼松、鱼丸、鱼豆腐、烤鱼片和鳕鱼肠在鱼类特异性FAM通道呈阳性；蟹棒、蟹酱和蟹酱产品在Cy5通道呈阳性。所有检测结果与产品标签声明完全一致。
3.7 LAMP方法检测虾过敏原的灵敏度评价
参照中国出入境检验检疫行业标准建立的LAMP方法，对虾基因组DNA的检出限同样为5 pg/μL，但反应时间需1小时。
讨论与结论
讨论部分指出，虾、蟹和鱼类虽富含营养，但也是高度致敏的食物，可引发从轻微呼吸道症状到严重过敏性休克的多种临床反应，尤其在亚洲国家，海鲜过敏发病率高且危害严重。现有检测方法如多重PCR、实时荧光PCR、微滴数字PCR（ddPCR）、LAMP、ELISA、LFIA和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）等虽各有应用，但普遍存在依赖精密仪器、操作繁琐、易受加工条件影响或成本高昂等局限性。本研究建立的双重Proofman-LMTIA方法有效解决了这些问题：它兼具高特异性、高灵敏度和良好稳定性，可在30分钟内完成等温扩增，无需热循环仪，适用于现场快速检测。其对虾和鱼类基因组DNA的检出限达5 pg/μL，蟹为10 pg/μL；在模拟肉混合物中，虾的检出限为4%（w/w），鱼类和蟹为8%（w/w）。与参考LAMP方法相比，该方法在保持相当灵敏度的同时实现了双重检测并将反应时间缩短一半，且降低了非特异性扩增风险。该方法已成功与冻干微球结合，并可通过便携式LAMP仪器实现现场扩增，未来有望进一步与微流控芯片技术整合以实现高通量快速检测。研究结论总结：本研究成功开发了一种双重Proofman-LMTIA方法，用于同步快速检测甲壳类（虾/蟹）和鱼类过敏原。与现有标准LAMP方法相比，该方法兼具高灵敏度、高特异性、良好稳定性和多重检测能力，可在30分钟内完成检测，有效降低假阳性风险，尤其适合快速现场检测。市售食品验证结果表明其在复杂食品基质中性能可靠稳定，为应对日益增长的食品过敏公共健康挑战提供了有价值的解决方案。
