明胶化核心联合低分子量壳聚糖包覆的谷胱甘肽脂质体：理化稳定性、硫醇保留及Caco-2细胞关联

《Foods》：Lemon Essential Oil-Enriched Alginate–Gelatin Coating Preserves Bioactive Quality in Strawberries: Extraction Protocol Effects and an Exploratory Modeling Approach

　　

谷胱甘肽（GSH）是一种具有强抗氧化活性的生物活性三肽，但其口服递送受胃肠道不稳定性和低膜通透性限制。本研究通过将明胶引入水性核心并结合低分子量壳聚糖（CS）包覆，开发了一种生物聚合物稳定的脂质体系统，以改善GSH保留和递送特性。制备并比较评价了常规脂质体（GSH/CL）、明胶化核心脂质体（GSH/GL）和CS包覆的明胶化核心脂质体（CS-GSH/GL）。GSH/GL的包封效率高于GSH/CL，CS包覆后进一步提高。基于总体理化性质，选择CS浓度为1.6 mg/mL的CS-GSH/GL配方为最优配方。CS-GSH/GL在氧化和酸性条件下也表现出改善的硫醇基团保留，并在所测试的pH条件下保持稳定分散。在模拟胃肠道条件下，CS-GSH/GL在脂质体制剂中显示最低的GSH累积释放，表明对包封GSH的保留改善。在Caco-2细胞中，当使用荧光模型化合物罗丹明B（rhodamine B）时，CS包覆的明胶化核心配方显示最高荧光强度。这些发现表明，核心明胶化和CS包覆联合改善了脂质体的理化稳定性和GSH保留，同时增强了负载罗丹明B的脂质体递送系统的细胞关联。总体而言，这些体外发现支持该配方在GSH保护和保留方面的潜力，但仍需进一步体内研究以评价其生物利用度和安全性。

本研究围绕谷胱甘肽（GSH，一种含硫醇基团的三肽）的口服递送难题展开。GSH参与细胞氧化还原调节和抗氧化防御，但口服后易受胃肠道降解、膜通透性低以及硫醇氧化所致理化不稳定的限制。为改善其稳定性与递送性能，研究人员将明胶引入脂质体（liposomes，磷脂双分子层囊泡）水性核心，并以低分子量壳聚糖（CS，一种阳离子多糖）进行表面包覆，构建生物聚合物稳定的脂质体系统；比较了GSH/CL、GSH/GL和CS-GSH/GL的理化性质、稳定性、释放行为、细胞毒性和细胞摄取。研究结论表明，明胶化核心与CS包覆联合可提高包封效率、改善氧化和pH条件下的硫醇保留、降低模拟胃肠道条件下的GSH累积释放，并增强以罗丹明B（Rho，荧光模型化合物）标记的脂质体在Caco-2细胞中的细胞关联；这些体外结果支持CS-GSH/GL用于GSH保护和保留的潜力，但其直接细胞内GSH摄取、肠道吸收和体内生物利用度尚未评价，仍需进一步体内研究。

关键技术方法（不超过250字）：采用改良薄膜水化法制备GSH/CL和GSH/GL，并以滴加法制备不同CS浓度的CS-GSH/GL，确定1.6 mg/mL为优选CS浓度；采用动态光散射（DLS）测定粒径、多分散指数（PDI，粒径分布宽度指标）和zeta电位，透析法结合高效液相色谱（HPLC，用于GSH定量）测定包封效率；采用Ellman法（以DTNB测定游离硫醇）评价H₂O₂氧化及pH 1、3、5、7条件下的硫醇保留；采用无酶模拟胃液（SGF，pH 1.2）和模拟肠液（SIF，pH 6.8）透析法结合HPLC评价释放；在Caco-2细胞（人结肠癌细胞系，常用肠上皮模型；来源于Korean Cell Line Bank）中进行MTT法（四唑盐比色法，测细胞活力）细胞毒性评价和Rho共聚焦激光扫描显微镜细胞摄取评价。未涉及动物或人群样本队列。

3.1 GSH负载脂质体的物理性质：通过DLS及透析/HPLC测定粒径、PDI、zeta电位和包封效率。GSH/CL粒径为100 ± 2 nm、PDI为0.260 ± 0.016、zeta电位为?55 ± 4 mV、包封效率为34 ± 6%；GSH/GL粒径为92 ± 2 nm、zeta电位为?22 ± 1 mV、包封效率为47 ± 3%，包封效率显著提高。CS包覆后粒径增至约200–210 nm，zeta电位转为27 ± 1至38 ± 1 mV，PDI随CS浓度增加而升高；1.6 mg/mL CS时包封效率增至63 ± 6%，被选为最优浓度。结论是明胶化核心改善包封并改变表面电荷，CS包覆进一步提高包封效率，但需控制CS浓度以维持分散性。

3.2 氧化稳定性：通过H₂O₂处理结合Ellman法测定硫醇基团含量。所有样品经氧化处理后硫醇含量均下降，但脂质体制剂显著高于游离GSH；CS-GSH/GL的硫醇保留最高，约为游离GSH的2.1倍。结论是明胶核心和CS包覆提高了氧化条件下GSH硫醇基团的保留。

3.3 pH稳定性：通过pH 1、3、5、7下的外观观察及Ellman法测定硫醇含量。pH 1和pH 3时浊度增加，GSH/GL在pH 3出现沉淀；CS-GSH/GL在各测试pH下均无可见沉淀。pH 1和pH 7时游离GSH和GSH/CL的硫醇含量显著降低，而GSH/GL和CS-GSH/GL保持较高硫醇水平；pH 1时CS-GSH/GL的硫醇含量约为游离GSH的10.2倍。结论是CS包覆改善酸性条件下的分散稳定性，明胶化核心联合CS包覆在测试pH范围内有效保留硫醇基团。

3.4 体外释放性质：通过无酶SGF（pH 1.2）2 h及SIF（pH 6.8）12 h透析法结合HPLC测定释放。游离GSH在SGF 2 h内快速释放约66%，12 h累积释放达86%；GSH/CL、GSH/GL和CS-GSH/GL的累积释放分别约为66%、54%和36%，CS-GSH/GL最低。结论是明胶掺入和CS包覆改善模拟胃肠道条件下的GSH保留和缓释行为；但所用模拟胃肠液不含消化酶或胆盐，释放结果主要反映pH和离子强度影响。

3.5 细胞毒性：通过Caco-2细胞MTT法评价10–80 μg/mL浓度范围内游离GSH和GSH负载脂质体的细胞毒性。所有样品细胞活力均高于90%，各配方间无显著差异。结论是在测试浓度范围内游离GSH和GSH负载脂质体在Caco-2细胞中均未见明显细胞毒性，具有生物相容性。

3.6 细胞摄取：通过Caco-2细胞中Rho标记脂质体的共聚焦激光扫描显微镜成像及LAS X软件定量评价细胞关联。细胞内平均荧光强度依次为游离Rho 21.81、Rho/CL 39.93、Rho/GL 63.96和CS-Rho/GL 88.14 a.u.，CS-Rho/GL约为游离Rho的4.0倍。结论是明胶化核心和CS包覆增强脂质体配方的细胞关联；由于Rho为荧光模型化合物而非GSH本身，该结果反映修饰脂质体系统的细胞关联行为，而非GSH的直接细胞内摄取。

讨论部分总结：原文讨论认为，明胶化核心后粒径降低与带正电明胶和脂膜负电区域间静电相互作用增加囊泡刚性和致密性有关；包封效率提高与明胶掺入后内水相黏度增加、减少制备过程中GSH泄漏有关。CS浓度过高可能通过相邻脂质体表面延展CS链间相互作用引起桥联絮凝，因此需适宜CS浓度以兼顾表面覆盖和分散稳定性；zeta电位由负转正支持带正电CS与脂质体表面结合。氧化条件下硫醇保留改善与明胶掺入和CS包覆增强结构保护、减少GSH暴露于外部氧化环境有关。pH 3时GSH/GL沉淀而pH 1不沉淀，原文指出明胶自缔合依赖pH相关静电相互作用，但未在各pH下测定粒径和zeta电位，因此相关解释仍属假设；CS包覆后的稳定性改善归因于CS的pH耐受性及保护性包覆作用。释放降低与明胶化核心增加黏度、降低分子扩散以及CS包覆增强扩散阻力和膜刚性有关；明胶与多糖间氢键、静电作用和离子键可能影响凝胶网络结构和水的迁移性。细胞关联增强可能与脂质囊泡与细胞膜相互作用、明胶掺入改变理化性质及CS包覆后正电表面促进与负电细胞膜相互作用有关。

研究结论翻译：本研究通过将明胶掺入水性核心并结合低分子量壳聚糖（CS）包覆，开发了一种用于GSH递送的生物聚合物稳定脂质体系统。与常规脂质体相比，明胶掺入提高了GSH包封效率，随后CS包覆进一步提高了包封效率并改变了脂质体表面电荷。CS包覆配方在酸性条件下也显示出改善的可见分散稳定性，并在本研究所考察的氧化和pH条件下具有更高的硫醇基团保留。在模拟胃肠道条件下，修饰脂质体配方的GSH释放低于游离GSH，其中CS-GSH/GL在所测试配方中显示最低的累积释放。这些结果表明，明胶掺入和CS包覆有助于GSH在脂质体结构内的更大保留。在Caco-2细胞中，当Rho用作荧光模型化合物时，CS包覆的明胶化核心配方显示最高荧光强度，表明修饰脂质体系统的细胞关联增强。总体而言，明胶化核心结构化和CS表面包覆的联合使用改善了脂质体配方的理化稳定性、GSH保留，同时增强了负载Rho递送系统的细胞关联。这些体外发现支持CS-GSH/GL用于GSH保护和保留的潜力。然而，未评价直接的细胞内GSH摄取、肠道吸收和体内生物利用度。因此，需要进一步研究以确立该配方用于口服GSH递送的适用性。