不同分子量（Mw）黑木耳多糖（AAPs）组分的呼吸道保护效应比较：从抗氧化依赖性镇咳作用到肠道菌群相关抗哮喘活性

《Foods》：Comparative Respiratory Protective Effects of Auricularia auricula Polysaccharide Fractions: From Antioxidant-Dependent Antitussive Effects to Microbiota-Associated Anti-Asthmatic Activity

　　

作为食药两用真菌，黑木耳（Auricularia auricula）以多糖（Auricularia auricula polysaccharides，AAPs）为主要生物活性成分。这些大分子的分子量（M_w）被认为是其生物利用度和生理效应的关键决定因素。然而，针对不同M_w AAPs呼吸道保护作用的系统性比较研究仍有限。本研究制备并表征了两种具有不同M_w的AAPs（1554 kDa和31 kDa），并评价其镇咳、祛痰和抗哮喘活性。结果显示，两种AAPs具有不同的单糖组成。与AAPs-H（1554 kDa）相比，AAPs-L（31 kDa）表现出更优的体外抗氧化活性、更好的溶解性和更低的黏度。此外，AAPs-L改善了氧化还原谱（超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）），并将P物质（substance P，SP）释放降低至2.17 pg/mL，从而减弱促炎介质级联反应。因此，经200 mg/kg BW AAPs-L处理的小鼠咳嗽频率显著降低、咳嗽潜伏期延长。相反，AAPs-H具有更高的M_w和甘露糖含量（50.24%），通过恢复Th₁/Th₂免疫平衡、调控NF-κB信号通路并重塑肠道菌群，发挥独特的抗哮喘作用，表现为Cryptobacteroides sp900546395丰度增加。两种AAPs均促进酚红排泄，表明具有祛痰作用。本研究综合评价并比较了不同M_w AAPs对小鼠呼吸系统的差异化保护作用，为M_w定制AAPs的功能食品应用和综合利用提供了新视角。

黑木耳（Auricularia auricula）是食药两用真菌，AAPs被认为是其主要活性成分，具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗氧化和降脂等生物活性。多糖是一类大分子，M_w被视为影响其生物利用度、受体相互作用及后续生理效应的决定性因素；高聚合度、结构复杂、黏度高和溶解性有限又常限制高M_w多糖的加工与应用。已有研究关注不同M_w AAPs的制备和结构特征，但这些多糖可能发生化学降解或结构修饰；单糖组成也可能是构效关系的关键因素。原文指出，尚无系统比较研究报道M_w如何影响AAPs对呼吸道疾病的保护效果。呼吸道疾病常见咳嗽、咳痰、喘息和肺部影像异常，病理机制涉及氧化应激、慢性炎症和免疫失调；气道活性氧（reactive oxygen species，ROS）过多可触发炎症级联，涉及免疫细胞和细胞因子，并破坏Th₁/Th₂免疫平衡，促进哮喘等疾病。NF-κB通路处于中心调控位置，肠-肺轴在调节肺部免疫和炎症中受到关注；AAPs可通过调节肠道菌群减轻急性肺损伤，但不同M_w AAPs是否及如何经肠-肺轴介导呼吸道保护仍有限。基于此，研究人员制备并表征1554 kDa和31 kDa两种AAPs，假设低M_w组分AAPs-L以较强自由基清除能力发挥抗氧化依赖性镇咳作用，高M_w组分AAPs-H以免疫调节潜力通过恢复Th₁/Th₂平衡、调控NF-κB通路和重塑肠道菌群缓解哮喘相关气道炎症，并评价镇咳、祛痰、抗哮喘、抗氧化、免疫调节、NF-κB介导抗炎和肠道菌群调控。研究结果支持两种AAPs具有差异化呼吸道保护作用，为M_w定制AAPs的膳食应用和开发提供新视角。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员制备AAPs-H与AAPs-L（AAPs-L制备含H₂O₂处理），并用凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC）、高效液相色谱、傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FT-IR）、刚果红实验及扫描电镜（scanning electron microscopy，SEM）表征；以ABTS⁺•、DPPH•、O₂^?•清除和还原力评价体外抗氧化。动物实验为三个独立队列：氨水诱导咳嗽、酚红祛痰和卵清蛋白（ovalbumin，OVA）诱导哮喘；BALB/C小鼠购自ZhuHai Bestest Biotechnology Co., Ltd.（珠海，广东，中国），咳嗽和祛痰实验用雄性小鼠，哮喘实验用雌性小鼠。检测支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）和肺组织生化指标、肺组织苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，H&E）染色、定量实时PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）、Western blot及肠道菌群16S rRNA V3–V4测序与PICRUSt2功能预测。

研究结果如下。3.1. Compositional Analysis and Structural Characterization of AAPs with Different Molecular Weights：通过GPC、单糖组成、FT-IR、刚果红和SEM分析，AAPs-H产率为14.8%，AAPs-L产率为45.7%；AAPs-H和AAPs-L的M_w分别为1554 kDa和31 kDa；AAPs-H以Man、Glc、Glc-UA和Xyl为主，AAPs-L以Glc、Man、Xyl和Glc-UA为主，AAPs-L的Glc比例较高、Man比例较低；FT-IR显示主要骨架结构保留，AAPs-L在1620 cm^?1吸收略减弱；两者均具有稳定三螺旋构象；SEM显示二者微观形貌不同。3.2. Physical Properties and Antioxidant Activity of AAPs with Different Molecular Weights：AAPs-H黏度随浓度明显升高，10 mg/mL达280 mPa·s，溶解时间约35 min；AAPs-L黏度低（<10 mPa·s）、溶解快（<5 min）；AAPs-L在ABTS⁺•、DPPH•、O₂^?•清除和还原力实验中均显著优于AAPs-H，提示M_w是AAPs抗氧化活性的关键决定因素。3.3. Effects of AAPs on Anti-Tussive Activity：氨水诱导咳嗽模型中，200 mg/kg AAPs-L和AAPs-H分别抑制咳嗽60.68%和58.18%，与枸橼酸喷托维林相当；AAPs-L显著延长咳嗽潜伏期并优于AAPs-H；AAPs-L改善肺组织SOD、GSH-Px和MDA，降低BALF中SP、CXCL1和IL-1β，AAPs-H对SP无显著影响，表明AAPs-L通过抗氧化和减轻炎症缓解咳嗽反射。3.4. Effects of AAPs on Expectorant Activity：酚红实验中，AAPs-L和AAPs-H均显著增强气管酚红输出，分别增加2.31倍和2.35倍，显示相似祛痰作用。3.5. Effects of AAPs on Anti-Asthmatic Activity：OVA诱导哮喘模型中，AAPs-L和AAPs-H均延长哮喘诱导潜伏期；AAPs-H降低脾指数和血清IgE，AAPs-L与模型组无显著差异；H&E显示AAPs-H对肺组织病理改善更明显，提示AAPs-H具有更强免疫调节潜力。3.6. Analysis of AAPs on Histopathological Changes in Lung Tissue of Asthmatic Mice：模型组出现支气管上皮排列不规则、上皮损伤、炎症细胞浸润和气道壁增厚；地塞米松（dexamethasone，DEX）和AAPs-H明显改善，AAPs-L仅部分改善，AAPs-H对肺组织结构的保护更明显。3.7. Effects of AAPs on Inflammatory Cytokine Expression and NF-κB Pathway in Asthmatic Mice：模型组BALF中TNF-α、IL-1β和IL-4最高；AAPs-H显著降低三者水平，与DEX无显著差异，AAPs-L无显著差异；qPCR显示AAPs-H降低TNF-α、IL-1β和NF-κB p65 mRNA，Western blot显示AAPs-H降低p-p65/p65比值至模型41%，DEX为54.4%，AAPs-L为74.3%且与模型无显著差异，表明AAPs-H主要通过抑制NF-κB通路活化减轻气道炎症。3.8. Effects of AAPs on the Gut Microbiota of Asthmatic Mice：16S rRNA测序显示AAPs-H和AAPs-L均提高肠道菌群α多样性；β多样性显示组间结构差异，AAPs-H与模型组分离更明显；属水平Cryptobacteroides、Alistipes_A和Akkermansia存在显著组间差异，AAPs-H和DEX增加Cryptobacteroides丰度；种水平AAPs-H和DEX显著增加Cryptobacteroides sp900546395，DEX降低Akkermansia muciniphila_D；PICRUSt2预测显示代谢和遗传信息处理相关通路改变，Cryptobacteroides sp900546395对代谢通路贡献较高，提示AAPs-H可能通过重塑肠道菌群影响相关功能通路。

讨论部分总结：原文讨论指出，本研究首次揭示不同M_w AAPs对呼吸道疾病的差异化保护作用。AAPs-L（31 kDa）具有更强直接抗氧化和抗炎能力，因而镇咳作用更优；其低M_w、较高Glc含量、较平衡的Man/Glc比及更佳溶解性和低黏度有利于活性基团暴露和自由基清除。AAPs-H（原文讨论称1500 kDa，摘要为1554 kDa）Man含量较高，可能更易被Man受体识别，因而免疫调节潜力更强；其通过恢复Th₁/Th₂平衡、降低IL-4和TNF-α、降低IgE、抑制NF-κB磷酸化及下游TNF-α和IL-1β表达，并可能经肠-肺轴重塑肠道菌群，增加Cryptobacteroides sp900546395丰度；原文指出Cryptobacteroides属丰度与炎症负相关，其成员可产生短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs），但确切免疫调节机制尚待阐明。原文还指出，AAPs-L镇咳可能涉及ROS-SP-CXCL1轴，但直接因果证据尚缺乏，需进一步验证；两种AAPs均具有祛痰作用。研究结论（翻译）：总之，本研究制备并表征了两种具有不同M_w和组成的AAPs，并评价其对呼吸系统的保护作用。结果表明，AAPs-L（31 kDa）和AAPs-H（1554 kDa）均缓解小鼠咳嗽，AAPs-L更强的抗氧化能力可能促成该作用，使其在延长咳嗽潜伏期方面显著优于AAPs-H。在抗哮喘模型中，AAPs-H倾向于表现出更大益处，可减轻哮喘小鼠气道炎症并呈现抗哮喘倾向，这与恢复Th₁/Th₂免疫平衡、调节NF-κB信号通路和重塑肠道菌群相关。这些发现为不同M_w AAPs的功能食品开发和综合利用提供了新策略。