《Foods》：Influence of Turning Intervals on Microbial Succession and Volatile Aroma Development During On-Farm Cocoa Bean Fermentation
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本研究考察了泰国北部清迈地区农场级可可发酵过程中微生物群落及其相关理化特性的变化，研究在60 kg木箱规模下进行。研究比较了24 h和48 h两种翻拌间隔的发酵工艺。采用基于培养的计数方法和非培养依赖的分子技术对微生物种群进行监测。结果表明，乳酸菌（LAB）和
本研究考察了泰国北部清迈地区农场级可可发酵过程中微生物群落及其相关理化特性的变化，研究在60 kg木箱规模下进行。研究比较了24 h和48 h两种翻拌间隔的发酵工艺。采用基于培养的计数方法和非培养依赖的分子技术对微生物种群进行监测。结果表明，乳酸菌（LAB）和醋酸菌（AAB）是整个发酵过程中的优势微生物种群。多变量分析发现，发酵时间显著地将群落从以酵母（Saccharomyces和Hanseniaspora）和细菌（Limosilactobacillus fermentum）为主的群落，转向以耐酸Acetobacter pasteurianus为主的后期群落。此外，翻拌间隔强烈影响微生物群落结构，24 h间隔有利于Saccharomyces和Komagataeibacter的生长，而较长的48 h间隔则选择性促进Candida、Meyerozyma和Acinetobacter的生长。理化性质分析还表明，两种工艺中总酸度均增加而pH值降低，同时还原糖随时间下降。在24 h翻拌工艺（T24）中，还原糖从0 h时的64.80 mg/g降至144 h时的3.73 mg/g。类似地，在48 h翻拌工艺（T48）中，还原糖从0 h时的64.29 mg/g降至144 h时的3.21 mg/g。果胶酶活性被检测为两种工艺中的主要酶活性。此外，T24工艺显示Saccharomyces、Limosilactobacillus和Lentilactobacillus与关键的果香/甜香酯类化合物呈正相关，而在T48工艺中，Lentilactobacillus和Acinetobacter与异味相关挥发性标志物（丁酸和二甲基二硫醚）相关。总体而言，更频繁的翻拌明显促进更多与理想香气特征相关的挥发性化合物的产生，标准化翻拌方案有助于提高批次间香气开发的一致性，并在规模化过程中降低不良风味形成的风险。
论文解读
一、研究背景与意义
可可（Theobroma cacao L.）是巧克力生产的主要原料，其独特感官品质的形成需要经历发酵、干燥和烘焙等多个加工环节，其中发酵对最终产品质量尤为关键。这一生物过程能够转化糖类和酸类物质，降低不良的苦味和涩味，同时产生在烘焙阶段得以充分展现的关键风味和香气前体物质，最终决定巧克力的独特感官特征。
可可豆发酵是在农场通过传统方式自发进行的微生物过程。这一自发发酵表现出酵母、乳酸菌（LAB）和醋酸菌（AAB）的微生物演替规律，它们的代谢活动将可可果肉降解为终产物，将种子转化为风味增强的稳定豆粒。然而，自发发酵受特定种植和加工环境中多种真菌和细菌的驱动，是一个复杂过程。近年来，泰国可可种植面积不断扩大，合作社和小农日益认识到发酵是影响可可豆理化性质、感官品质和商业竞争力的关键环节。翻拌作为发酵过程中常用的工艺步骤，其间隔时间对发酵条件、微生物动态和豆粒品质均有显著影响。然而，小农在劳动力和时间方面常面临限制，频繁翻拌会增加劳动需求，可能不适用于小规模生产者。因此，确定既能支持稳定发酵又能降低劳动需求的实用翻拌间隔，对提高农场可可发酵的可行性具有重要意义。目前关于泰国农场可可发酵过程中微生物群落时间动态及其与品质形成关系的科学证据仍然有限。
二、研究设计与技术方法
研究人员在泰国清迈地区采用60 kg木箱规模进行农场可可发酵实验，使用Chumphon 1品种（特立尼达杂交种PA7和NA32品种）的完全成熟可可豆。实验设置两个处理：T24工艺每24 h翻拌一次，T48工艺每48 h翻拌一次，发酵持续6天（144 h），每24 h采样一次。研究采用了以下主要关键技术方法：基于培养的微生物计数方法，使用选择性培养基对酵母、乳酸菌、醋酸菌、产孢细菌和肠杆菌进行计数；非培养依赖的高通量测序技术，通过扩增细菌16S rRNA基因V3-V4区和真菌ITS区进行扩增子测序，结合DADA2算法进行去噪和嵌合体去除，利用QIIME 2进行物种注释；理化参数监测，包括温度、pH、总可滴定酸度和还原糖含量的测定；酶活性分析，采用DNS比色法测定果胶酶、淀粉酶、羧甲基纤维素酶、甘露聚糖酶和木聚糖酶活性；以及气相色谱电子鼻（GC E-Nose）系统对挥发性有机化合物（VOCs）进行分离和鉴定。
三、研究结果
3.1 可可发酵过程中的微生物变化
两种翻拌工艺中的活菌数量在24 h后增加，在72 h时保持相对稳定在约6.5 log CFU/g，随后在144 h时再次增至约8.0 log CFU/g。乳酸菌在发酵早期（0–48 h）占主导地位，48 h后迅速达到约9.0 log CFU/g的峰值，随后趋于稳定并在发酵后期略有下降。酵母种群在两种工艺中表现相似，在最初24–48 h内迅速增加至约6.5 log CFU/g的峰值，随后逐渐下降至144 h时约5.0 log CFU/g。产孢细菌在两种工艺的前96 h内均未检出，T24在120 h、T48在144 h开始出现。肠杆菌在发酵早期（0–72 h）出现，96 h后未检出。
3.2 真菌种群的聚类分析
在T24工艺中，Hanseniaspora酵母（尤其是H. pseudoguilliermondii）在发酵初期占主导，随后在48 h时转变为以Saccharomyces cerevisiae为主要类群，发酵中期（72和96 h）出现Meyerozyma、Candida和Cortinarius。相比之下，T48工艺中H. pseudoguilliermondii和Meyerozyma caribbica在早期（24至48 h）占主导，而Saccharomyces则有所下降。典范对应分析（CCA）显示，发酵时间（R2 = 0.594，p = 0.006）和翻拌间隔（R2 = 0.413，p = 0.039）均与群落组成变异显著相关。Saccharomyces与48 h翻拌间隔呈显著负相关，表明更频繁的24 h翻拌策略对其种群维持极为有利；而48 h间隔则正向选择Meyerozyma和Candida等氧化型酵母属。
3.3 可可发酵过程中的细菌动态
在T24工艺中，Limosilactobacillus fermentum在48 h时达到优势地位，随后Acetobacter pasteurianus在96至144 h期间占据主导（80–90%）。更频繁的翻拌促进了醋酸菌（包括Acetobacter和Komagataeibacter）更明显的演替。相比之下，T48工艺中L. fermentum和A. pasteurianus的丰度较低，延长厌氧状态延迟了Acetobacter的发展，增加了Acinetobacter的相对丰度。冗余分析（RDA）显示，发酵时间（R2 = 0.532，p = 0.006）和翻拌间隔（R2 = 0.716，p = 0.002）均与细菌群落结构显著相关。24 h翻拌策略强烈有利于Komagataeibacter，而48 h间隔则正向选择Acinetobacter、Garicola和Allorhizobium-Neorhizobium-Pararhizobium-Rhizobium复合群。
3.4 可可发酵过程中的理化性质
温度方面，T24工艺从约28 °C逐渐升至72 h时约50 °C，随后下降并稳定在约45 °C；T48工艺温度比T24低2–3 °C。总酸含量在两种工艺中均增加，T48在96 h时达到1.52%（w/w）的最大值，随后在144 h时降至约1%（w/w）；T24在72 h时达到约1%（w/w）的最大值，发酵结束时略降至0.75%（w/w）。pH值从初始的6降至5，T24因挥发性酸消散增强而维持略高的pH值。还原糖含量在24 h后急剧下降，T24从64.80 mg/g降至144 h时的3.73 mg/g，T48从64.29 mg/g降至3.21 mg/g。
酶活性方面，T24工艺中果胶酶活性快速增加并在96 h达到峰值，甘露聚糖酶在72 h达到峰值，淀粉酶和木聚糖酶在24 h达到峰值后持续下降，羧甲基纤维素酶（CMCase）在整个发酵过程中活性极低。T48工艺中CMCase在48 h时活性最高，果胶酶在120 h达到峰值，甘露聚糖酶在48 h达到最大值，淀粉酶在24至96 h间检出，木聚糖酶活性整体较低。
挥发性化合物方面，共鉴定出46种挥发性化合物，包括酯类、酸类、醇类、吡嗪类及含氮化合物、醛酮类、萜烯类和含硫化合物。T24工艺检出的挥发性化合物数量高于T48。T24中与果香相关的化合物（乙酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸异戊酯）在发酵早期出现，坚果香和面包香相关化合物（3-庚烯-2-酮、2-甲基丁醛、2,3-二甲基吡嗪等）在发酵后期出现。T48中果香和坚果香均在发酵末期检出，酸类香气（与异味相关）主要在T24中观察到。
3.5 微生物种群与挥发性化合物的相关性分析
在T24工艺中，Saccharomyces、Limosilactobacillus和Lentilactobacillus与关键果香/甜香酯类化合物（乙酸异戊酯、丁酸乙酯、己酸甲酯、反式-2-丁烯酸乙酯）、多元醇/高级醇（2,3-丁二醇、2-丙醇、S(-)2-甲基-1-丁醇）、萜烯（α-蒎烯）和吡嗪类（2,3-二甲基吡嗪）显著正相关。在T48工艺中，Lentilactobacillus和Acinetobacter与丁酸和二甲基二硫醚显著相关，这些化合物与最终可可液块中的酸败、刺激性异味有关。
四、结论与讨论
研究结论表明，翻拌间隔显著影响可可发酵过程中的微生物演替、理化变化和挥发性风味形成。乳酸菌和醋酸菌在两种处理中均占主导地位，肠杆菌在72 h后下降并在96 h时未检出，表明发酵有效抑制了不良微生物。S. cerevisiae和H. pseudoguilliermondii促进了早期乙醇生产和果胶降解，果胶酶是主要的酶活性。24 h翻拌处理（T24）通过Saccharomyces、Limosilactobacillus和Lentilactobacillus与果香和甜香酯类化合物正相关，而48 h处理（T48）中Lentilactobacillus和Acinetobacter与异味相关挥发性标志物相关。总体而言，更频繁的翻拌可能促进微生物群落的差异，增加与理想可可香气特征相关的挥发性化合物的丰度。这些发现也为工业发酵工艺和管理提供了改进建议。然而，未来需要使用多个独立发酵箱并在不同收获季节进行研究，以确认翻拌间隔效应的可重复性，并评估其对感官属性和巧克力产品质量的影响。
