褐藻叶状萱藻水提物（KDC22-01）通过抑制tau蛋白过度磷酸化改善东莨菪碱诱导的小鼠记忆损伤

《Nutrients》：Ishige foliacea Water Extract (KDC22-01) Attenuates Tau Hyperphosphorylation and Ameliorates Scopolamine-Induced Memory Impairment in Mice

　　

摘要 背景/目的：叶状萱藻（Ishige foliacea）是一种可食用的褐藻，含有具有神经保护作用的生物活性多酚类物质。尽管已有研究表明叶状萱藻提取物能够改善认知损伤，但其对病理性tau蛋白磷酸化的影响仍缺乏充分表征。本研究探讨了KDC22-01（叶状萱藻水提物）的神经保护及认知调节作用。方法：通过总多酚和总黄酮当量含量测定及高效液相色谱（HPLC）指纹图谱对KDC22-01进行化学表征。在SH-SY5Y细胞中评估其对预聚集Aβ25–35诱导的细胞毒性和冈田酸（OA）诱导的tau蛋白磷酸化的影响。进一步在雄性C57BL/6小鼠中，通过口服给予KDC22-01（100或300 mg/kg），评估东莨菪碱（SCO）诱导的认知损伤模型中的认知表现及海马tau蛋白磷酸化水平。结果：KDC22-01能够保护SH-SY5Y细胞免受Aβ25–35诱导的细胞毒性，在50 μg/mL浓度下将细胞活力从约59%恢复至对照水平的87%。KDC22-01在25和50 μg/mL浓度下均能降低OA诱导的p-tau（Ser199）/总tau比值。在SCO处理的小鼠中，100 mg/kg KDC22-01显著改善了Morris水迷宫和被动回避测试中的表现，而Y迷宫自发交替的改善未达到统计学显著性。两种剂量的KDC22-01均降低了海马p-tau（Ser396）水平，而海马Aβ水平的变化无统计学显著性。结论：这些发现表明，抑制tau蛋白过度磷酸化可能有助于KDC22-01的认知改善作用，并支持进一步将该叶状萱藻水提物作为认知健康候选功能性食品配料进行研究。

论文解读：叶状萱藻水提物（KDC22-01）通过抑制tau蛋白过度磷酸化改善东莨菪碱诱导的小鼠记忆损伤

一、研究背景与科学问题

阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种进行性神经退行性疾病，也是痴呆的首要病因，其生物学特征为淀粉样β（amyloid-β, Aβ）沉积和tau蛋白病理，临床表现为记忆及其他认知功能的进行性损害。除淀粉样蛋白和tau蛋白异常外，基底前脑胆碱能系统功能障碍与认知衰退密切相关，因为投射至大脑皮层和海马的胆碱能通路对注意力、学习和记忆具有关键调控作用。基底前脑胆碱能神经元在衰老和AD过程中选择性易损，其变性导致胆碱能神经传递受损和认知功能障碍。tau蛋白是一种参与细胞骨架稳定和轴突功能的微管相关蛋白，在AD中发生异常过度磷酸化，降低其对微管的亲和力，促进成对螺旋丝和神经原纤维缠结的形成。重要的是，脑内tau蛋白负荷增加与随后的认知恶化密切相关，tau正电子发射断层扫描（PET）测量在预测症状性AD连续谱个体认知衰退方面具有重要的预后价值。上述观察支持将胆碱能功能障碍和异常tau蛋白磷酸化作为研究旨在保护认知功能的干预措施的生物学相关靶点。

东莨菪碱（scopolamine, SCO）是一种非选择性毒蕈碱型乙酰胆碱受体拮抗剂，可产生可重复的学习、记忆和注意力缺陷，因此被广泛用作胆碱能认知损伤的药理学模型，用于候选认知调节剂的临床前评价。然而，东莨菪碱产生的是急性和可逆的胆碱能缺陷，不能重现AD进行性和多因素神经病理学特征。因此，它更适合被视为胆碱能认知损伤模型而非完整的AD模型。在细胞水平上，冈田酸（okadaic acid, OA）介导的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶抑制常用于诱导SH-SY5Y细胞中tau蛋白过度磷酸化，为评估调节病理性tau蛋白磷酸化的化合物提供了互补的实验系统。针对胆碱能功能障碍和tau蛋白磷酸化的药理学模型的联合使用，可为候选神经保护剂的认知和分子效应提供互补信息。

海洋褐藻是结构多样的生物活性代谢物的丰富来源，尤其是褐藻特征性的间苯三酚基多酚——褐藻多酚（phlorotannins），因其抗氧化和神经保护特性而受到广泛关注。实验研究表明，富含褐藻多酚的提取物和单体褐藻多酚（包括dieckol及相关化合物）能够保护神经元免受氧化或毒性损伤，并调节与胆碱能功能、氧化应激、神经炎症和认知损伤相关的通路。叶状萱藻（Ishige foliacea）是一种在东亚国家用作功能性食品的可食用褐藻，作为生物活性酚类化合物的来源备受关注。此前一项研究表明，叶状萱藻乙醇提取物具有抗氧化和乙酰胆碱酯酶及β-分泌酶抑制活性，可保护SH-SY5Y细胞免受H₂O₂和Aβ诱导的细胞毒性，并通过调节海马BDNF–TrkB–ERK信号通路改善东莨菪碱诱导的记忆缺陷。该研究主要聚焦于氧化应激、淀粉样相关酶活性、胆碱能机制和神经营养信号；叶状萱藻对病理性tau蛋白磷酸化的影响仍未得到充分表征。与此前研究使用的乙醇提取物不同，研究人员制备了水提物，因为水提可避免有机溶剂残留，适用于食品级配料的制造。本研究通过评估SH-SY5Y细胞中Aβ_25–35诱导的细胞毒性和OA诱导的tau蛋白过度磷酸化，以及评估东莨菪碱诱导的认知损伤小鼠模型中的认知表现和海马tau蛋白磷酸化，研究了叶状萱藻水提物（KDC22-01）的神经保护和认知调节作用。

二、研究内容与主要结论

本研究聚焦于叶状萱藻水提物KDC22-01在体外对Aβ诱导的神经元损伤和tau蛋白过度磷酸化的影响，以及在东莨菪碱诱导的胆碱能认知损伤模型中对认知表现和海马tau蛋白磷酸化的影响。研究结果表明，KDC22-01在体外能够保护SH-SY5Y细胞免受预聚集Aβ_25–35诱导的细胞毒性，并减弱OA诱导的tau蛋白过度磷酸化；在体内，100 mg/kg KDC22-01显著改善了东莨菪碱处理小鼠在Morris水迷宫和被动回避测试中的表现，两种剂量均显著降低了海马p-tau（Ser396）水平。这些发现提示，调节tau蛋白磷酸化可能有助于KDC22-01的认知保护作用，支持其作为认知健康候选功能性食品配料的进一步研究。

三、关键技术方法

研究人员从韩国济州岛采集的干燥叶状萱藻（2022年6月采集于韩国Chuja岛，购自PARA Jeju）以100%蒸馏水在70°C提取4小时，经10-μm过滤、浓缩、90°C巴氏灭菌20分钟后喷雾干燥，获得KDC22-01。采用反相高效液相色谱（HPLC）指纹图谱进行化学表征，以dieckol为标志性褐藻多酚。采用Folin–Ciocalteu法和氯化铝比色法分别测定总多酚和总黄酮含量。体外实验使用SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞（KCLB No. 22266），通过MTT法评估细胞活力和细胞保护作用，采用ELISA试剂盒定量总tau和p-tau（Ser199）。动物实验使用4周龄雄性C57BL/6小鼠（KOATECH Animal, Pyeongtaek, Korea），随机分为4组（每组6只），口服灌胃给予KDC22-01（100或300 mg/kg）或溶媒连续12天，行为学测试（Y迷宫、被动回避和Morris水迷宫）在第13–15天进行，东莨菪碱（1.4 mg/kg，腹腔注射）在每次测试前30分钟给予。海马组织采用Western blot分析p-tau（Ser396）、总tau、Aβ_1–42和β-actin。

四、研究结果

4.1 KDC22-01的化学表征

KDC22-01的总多酚含量为54.06 ± 2.24 mg GAE/g提取物，总黄酮含量为43.26 ± 0.71 mg QE/g提取物。同一批KDC22-01用于所有实验，体外25和50 μg/mL时总多酚递送量分别为1.35和2.70 μg GAE/mL，体内100和300 mg/kg时分别为5.41和16.2 mg GAE/kg。

4.2 KDC22-01在体外对Aβ_25–35诱导毒性的保护作用

KDC22-01在5–100 μg/mL浓度范围内处理24小时未显著降低细胞活力。预聚集Aβ_25–35以浓度依赖性方式降低细胞活力，在10、50、100和200 μM时分别降至对照的约90%、75%、58%和35%。在细胞保护实验中，50 μM Aβ_25–35处理48小时显著降低细胞活力，而KDC22-01（25或50 μg/mL）预处理显著减弱了Aβ_25–35诱导的细胞活力丧失，尤其在50 μg/mL时效果显著，将细胞活力从约59%恢复至对照水平的87%。

4.3 KDC22-01减弱OA诱导的tau蛋白过度磷酸化

OA以浓度依赖性方式降低细胞活力，但仅在90 nM时显著（约为对照的75%）。在60 nM（用于诱导tau过度磷酸化的浓度）时，细胞活力约为对照的88%，无显著差异。OA处理显著增加了p-tau（Ser199）/总tau比值，而KDC22-01在25和50 μg/mL浓度下均显著降低了OA诱导的p-tau（Ser199）/总tau比值，表明KDC22-01可能调节参与tau磷酸化的激酶–磷酸酶信号。

4.4 KDC22-01改善SCO诱导的认知损伤

在Morris水迷宫测试中，SCO显著增加了逃逸潜伏期，而100 mg/kg KDC22-01显著降低了逃逸潜伏期。在被动回避测试中，SCO组在明箱停留时间显著减少，100 mg/kg KDC22-01显著增加了明箱停留时间，而300 mg/kg的积极效果未达到统计学显著性。在Y迷宫测试中，SCO显著降低了自发交替率，KDC22-01处理使自发交替率分别提高25%（100 mg/kg）和31%（300 mg/kg），但均未达到统计学显著性。这些结果表明，KDC22-01在100 mg/kg剂量下显著改善了东莨菪碱诱导的空间学习和联想记忆损伤，而工作记忆的改善未达显著水平。

4.5 KDC22-01抑制海马tau蛋白磷酸化

Western blot分析显示，SCO组海马p-tau（Ser396）/总tau比值显著高于对照组，而KDC22-01在100和300 mg/kg两种剂量下均显著降低了SCO相关的p-tau（Ser396）升高。海马Aβ_1–42水平在SCO组趋于升高（约25%），KDC22-01处理后趋于降低，但均无统计学显著性。

五、讨论与结论

讨论部分指出，SCO模型代表急性胆碱能神经传递的药理学破坏，不能重现AD的进行性淀粉样蛋白和tau病理。KDC22-01在Morris水迷宫和被动回避测试中的显著改善效果，与其对海马依赖性空间学习和联想记忆的促进作用一致，而Y迷宫自发交替的改善未达显著，可能反映三种测试所评估的认知过程和神经基础存在差异。水提物乙酰胆碱酯酶抑制活性较低，可能使其在对抗急性毒蕈碱阻断方面效果有限。研究局限性包括：样本量较小且仅使用雄性小鼠；未设置阳性药物对照和单独KDC22-01处理组；tau磷酸化位点在不同模型中不一致；未评估上游信号机制（GSK-3β、CDK5和PP2A活性）；未定量单个褐藻多酚含量。

结论：KDC22-01（叶状萱藻水提物）在SH-SY5Y细胞中发挥对抗预聚集Aβ_25–35诱导毒性的细胞保护作用，并减弱OA诱导的tau蛋白过度磷酸化。在东莨菪碱处理的小鼠中，KDC22-01改善了空间和情境记忆的特定指标，并显著降低了海马Ser396位点的tau蛋白磷酸化。这些发现表明，tau蛋白磷酸化的调节可能有助于KDC22-01的认知保护作用，支持对其潜在机制及作为功能性食品配料应用的进一步研究。