转录组引导鉴定参与Arthrobotrys oligospora捕器形成的两个G蛋白偶联受体（GPCR）候选

《International Journal of Molecular Sciences》：Transcriptome-Guided Identification of Two GPCR Candidates Contributing to Trap Formation in Arthrobotrys oligospora

G蛋白偶联受体（GPCRs）连接环境线索与真菌发育，但线虫捕食真菌中许多候选受体的功能仍未明确。研究人员结合参考基因组挖掘、公共转录组分析和功能实验，研究Arthrobotrys oligospora ATCC 24927中与捕器形成相关的GPCR候选。基因组挖掘获得87个候选受体，包括两个暂定条目。对九个保留的基因表达综合数据库（GEO）系列进行转录组分析，支持一个由三个候选组成的探索性短名单，命名为AoGrn1、AoGrn2和AoGrn3。AoGrn1或AoGrn2缺失降低线虫诱导的捕器形成，回补部分恢复该表型。在测试条件下，AoGrn3缺失未产生统计学可检测的捕器密度变化。在HEK293F细胞中，线虫提取物在AoGrn1–AoGpa2和AoGrn2–AoGpa1组合中引发生物发光共振能量转移（BRET）响应。AlphaFold2-Multimer模型提示胞内受体–Gα界面，尽管模型评分偏好与观察到的响应谱并不一致。这些发现支持AoGrn1和AoGrn2在捕器形成中的作用，并鉴定出用于进一步研究猎物相关信号的受体–Gα组合。活性提取物组分及天然真菌中相应偶联关系仍有待确立。

研究背景与问题：真菌通过环境感知启动侵染或捕获结构形成。G蛋白偶联受体（GPCR）将胞外线索连接至异三聚体G蛋白及下游信号网络，调控真菌发育、胁迫适应和宿主互作。线虫捕食真菌为研究胞外线索如何触发捕食性分化提供了可操作体系。Arthrobotrys oligospora在营养限制下形成黏性网捕获并消化线虫，线虫来源的ascaroside信息素可诱导捕器形成。已有研究鉴定Gpr2、Gpr3和Gin3参与猎物感知，Gpr2/Gpr3通过AoGpa2响应ascaroside，Gin3参与其他线虫线索；A. flagrans中GprC与GasA协调转录重编程和线粒体呼吸。下游Gpb1、Fus3丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联、Ste12、AoGpa2–环腺苷酸–蛋白激酶A（cAMP–PKA）、Ric8及高渗甘油（HOG）等通路参与捕器形态发生，但将下游程序与单个受体连接仍需更广泛的GPCR功能表征及Gα响应偏好分析。因此，研究人员围绕A. oligospora ATCC 24927中未表征GPCR候选是否参与线虫诱导捕器形成开展研究。

研究人员开展了参考基因组受体库存构建、公共转录组优先排序、基因缺失与回补、异源BRET响应检测及AlphaFold2-Multimer界面建模。结论是AoGrn1和AoGrn2促进线虫诱导的捕器形成，AoGrn3在测试条件下未显示统计学可检测的捕器数量表型；线虫提取物（NE）在HEK293F细胞中引发AoGrn1–AoGpa2和AoGrn2–AoGpa1组合的BRET变化；结构模型提示胞内受体–Gα界面，但模型评分偏好与BRET响应并不完全一致。该研究将两个候选受体与捕食性发育联系起来，并提出候选受体–Gα组合和接触残基假设，为后续猎物相关信号研究提供基础；活性提取物组分及天然真菌中的偶联关系仍待确立。

关键技术方法：参考基因组挖掘与跨膜拓扑、结构域注释，MAFFT/IQ-TREE系统发育分析；AlphaFold2-Multimer（多聚体结构预测工具）构建267个受体–Gα组合并评分；收集公共GEO（基因表达综合数据库）资源（12个系列、213个样本记录、19个表达/计数矩阵；保留9个系列）进行转录组优先排序；CRISPR/Cas9（CRISPR相关蛋白9）介导基因缺失与回补；生长和线虫诱导捕器密度实验；NE制备；HEK293F细胞BRET2 G蛋白传感器；免疫荧光；qRT-PCR（定量逆转录PCR）；界面与构象分析及统计。样本来源为A. oligospora ATCC 24927和公共GEO系列。

结果部分：
2.1. Reference-Genome Mining Defines 87 Candidate GPCRs and Their Predicted Gα Interfaces：通过参考基因组再注释、跨膜拓扑预测、结构域注释和系统发育分析，研究人员建立候选GPCR库存。摘要概括为87个候选受体（含两个暂定条目）；正文再注释列出89个初始候选，其中84个预测含7次跨膜、5个含6次跨膜，两个仅具通用跨膜蛋白注释且缺乏GPCR域支持的六次跨膜条目在系统发育和结构分析中保留，但排除于转录组优先排序，最终87个保留候选用于后续分析。多数候选为Pth11-like，另有Class III、GOST/Lung-7TM、STE2、STE3等类别；与已发表受体库比较新增17个候选。AlphaFold2-Multimer建模产生267个受体–Gα组合和801个评分模型；AoGpa1在多数候选最高评分，但该分析未建立功能偶联选择性，仅提供候选界面。

2.2. Integrated Multi-Transcriptome Analysis Prioritizes Three Uncharacterized GPCRs：通过将87个候选映射至九个GEO系列，获得783个受体–系列估计；78个受体至少一个系列满足Benjamini–Hochberg校正q < 0.05，47个至少在三个独立系列有支持。以87个GPCR库存、线虫暴露响应、渗透感应MAPK扰动数据集支持和cAMP–PKA扰动数据集支持四项标准筛选出16个候选；排除已命名或实验检验的GIN2、GIN6和GIN9后，对13个未表征候选按两个模块最大绝对log₂倍数变化之和排序。AOL_s00007g309（AoGrn1）、AOL_s00054g150（AoGrn3）和AOL_s00176g42（AoGrn2）得分最高，分别为6.260、4.731和4.702，第四位为4.692。三个候选响应谱不同，显示线虫响应性与信号通路扰动转录敏感性共同支持其选择。

2.3. AoGrn1 and AoGrn2 Promote Trap Formation：通过CRISPR/Cas9介导替换、诊断PCR、回补、生长轨迹和捕器计数分析，研究人员发现WT培养在诱导后30 h产生115.8 ± 30.8 traps cm^?2；三个ΔAoGrn1分离株为28.4–35.2 traps cm^?2，较WT低69.6–75.5%；三个ΔAoGrn2分离株为12.9–17.2 traps cm^?2，较WT低85.1–88.9%，均与WT显著不同。ΔAoGrn3分离株为104.1–122.5 traps cm^?2，与WT无统计学差异。回补使AoGrn1和AoGrn2捕器密度分别恢复至72.3 ± 20.1和49.6 ± 12.5 traps cm^?2，高于相应缺失株但仍低于WT，提示部分恢复。生长轨迹视觉相似；qRT-PCR中缺失株目标转录未检测到，WT 10 h/0 h估计比值分别为2.57、1.72和9.76，但Holm校正后均未显著，仅作描述性报告。结论支持AoGrn1和AoGrn2参与捕器形成。

2.4. AoGrn1 and AoGrn2 Show Distinct Gα Responses in HEK293F Cells：通过HEK293F细胞BRET生物传感器和免疫荧光，研究人员观察到NE稀释系列中AoGrn1–AoGpa2与AoGrn2–AoGpa1出现净BRET降低，其他受体–Gα组合相对平坦；HA-Grn1、HA-Grn2及阳性对照HA-Gin3均有表达，呈周边膜相关荧光并伴胞内核周和囊泡染色。AlphaFold2-Multimer模型将Gα C端α5螺旋置于胞内受体腔；AoGrn1–AoGpa2模型中D127（ICL2）、P130（TM4）和K210（ICL3）受体侧埋藏面积贡献最大，AoGrn2–AoGpa1模型中R122（ICL2）、L118（TM3）和R35（ICL1）贡献最大。AoGrn2受体侧接触残基对数按AoGpa1（65）>AoGpa2（13）>AoGpa3（5）递减，与BRET降低组合一致；AoGrn1三种界面接触数相近且AoGpa1评分最高，但BRET变化仅见于AoGpa2，模型不能区分其伙伴。ipTM绝对值较低（0.29–0.37），模型界面仅作为待检验假设。

讨论部分总结：讨论指出AoGrn1和AoGrn2的缺失及部分回补表型是将其与捕器发育联系的主要证据；部分恢复可能受转基因表达或插入背景影响。已有Gpr2/Gpr3/Gin3及GprC–GasA框架得到扩展，但粗提物响应不能确定受体识别ascaroside、其他猎物分子或混合刺激。植物病原真菌Pth11和Fusarium graminearum扩展GPCR亚家族提供比较背景，但不建立共享配体或CFEM依赖机制。捕器形成涉及协调信号和细胞分化，基础生长差异需在解释表型时考虑；本研究中非WT菌株生长AUC均值较低，但个体比较经Holm校正未显著。AoGrn3缺失无统计学可检测捕器数量表型，说明转录优先排序不必然预测单基因缺失效应；冗余和条件依赖功能仍为待检验假设。qRT-PCR估计在猎物暴露后升高但未显著，AoGrn3估计增幅最大却无表型，提示表达变化幅度对缺失效应预测有限；目标转录在缺失株未检测到，AoGrn2暴露后估计方向与早期公共转录组区间 modest decrease 不同，且Tub扩增效率较高限制定量解释。结构预测与BRET比较显示受体特异性一致或不一致：AoGrn1最高模型评分伙伴为AoGpa1而可检测响应见于AoGpa2；AoGrn2最高评分伙伴和响应均涉及AoGpa1但ipTM低。模型一致不等于验证界面或偶联选择性；BRET还依赖供体–受体距离和相对取向。异源实验提供受控比较环境，但渗透化免疫荧光不能区分表面与胞内受体池，平坦曲线不证明绝对不能偶联某一Gα；天然细胞背景、定位和运输、NE活性成分及天然Gα依赖性均需进一步研究。初始89个蛋白中排除两个无GPCR域支持条目后保留87个，扩大受体研究基础；与已发表TWF154库比较需考虑菌株背景、基因注释和候选鉴定标准，排名应视为探索性短名单，功能分析区分了AoGrn1/AoGrn2的捕器相关表型与AoGrn3无可检测捕器数量表型。

研究结论部分翻译：基因组规模受体图谱和跨研究转录优先排序鉴定AoGrn1和AoGrn2为候选受体，参与A. oligospora线虫诱导的捕器形成。遗传缺失和回补分析支持其参与捕器发育，转录谱确认其在猎物暴露后诱导。此外，HEK293F细胞异源BRET实验揭示AoGrn1–AoGpa2和AoGrn2–AoGpa1组合中不同的线虫提取物引发响应谱。结合结构界面建模，这些发现建立候选受体–Gα配对和预测接触残基，为未来研究A. oligospora如何感知猎物线索以启动捕食性发育提供基础。