烟碱型乙酰胆碱受体在交感神经过度刺激下调节心肌细胞T-微管结构

《International Journal of Molecular Sciences》：Nicotinic Acetylcholine Receptors Modulate T-Tubule Architecture Under Sympathetic Overstimulation

　　

病理性的横管（T-tubules, TTs）重塑常见于心脏疾病，并可能由持续的肾上腺素能刺激所促进。尽管胆碱能信号与心脏保护效应相关，但其是否直接调控心肌细胞中TT的完整性仍不明确。本研究探讨了在急性β-肾上腺素能刺激下，胆碱能受体激活如何影响分离的成年大鼠心肌细胞中的TT组织。研究人员将细胞暴露于异丙肾上腺素（ISO），单独或联合乙酰胆碱（ACh）或尼古丁（Nic）处理。共聚焦成像显示，ISO破坏了TT的组织结构并降低了细胞的长度与宽度比（L/W）。单独使用ACh或Nic改变了TT的结构，主要表现为降低TT功率并增加纵向微管密度；然而，与任一激动剂联合处理均与ISO诱导的TT结构和细胞形态改变中不同的TT重塑反应相关。毒蕈碱型受体激动剂呫诺美林（Xano）未重现这些效应。这些结果表明，nAChR信号在限制急性β-肾上腺素能刺激诱导的TT重塑中发挥心肌细胞自主性作用。需要进一步研究来鉴定涉及的nAChR亚型和下游信号机制，并确定这些发现在体内的相关性。

研究背景与科学问题

心肌细胞的横管（T-tubules, TTs）是细胞表面膜的内陷结构，可显著增加膜表面积并将细胞外信号转导至细胞内。TT网络的病理性重塑——通常表现为整体密度降低和横向取向丧失——是心力衰竭、慢性缺血和心房颤动等多种心脏疾病的标志特征。TT系统的形成与维持高度动态，受多种蛋白（如桥接整合因子1, BIN1和亲联蛋白2, JPH2）及多种因素调控。例如，β-肾上腺素能通路的激活可通过破坏BIN1微域以及增加钙蛋白酶介导的JPH2剪切来使TT结构失稳。在生理条件下，交感神经的作用由副交感胆碱能系统平衡。传统上，来自迷走神经末梢或心肌细胞自身的乙酰胆碱（ACh）结合M2型毒蕈碱型乙酰胆碱受体（mAChR），从而发挥负性变时、负性传导和负性肌力效应。近年来，烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR），尤其是α7nAChR，被证实在心室心肌细胞上表达。此外，既往研究表明，缺乏α7nAChR的心肌细胞对非选择性β-肾上腺素能受体激动剂异丙肾上腺素（ISO）诱导的细胞毒性更易感，提示α7nAChR发挥独立于抗炎功能的细胞自主性保护作用。然而，这种非炎症性心脏保护的 structural 基础仍不清楚，尤其是在TT微域的维持方面。因此，确定胆碱能信号是否以及如何在交感应激下减轻TT降解至关重要。

研究内容与主要结论

研究人员采用分离的成年大鼠心肌细胞，分别给予ISO、ACh、尼古丁（Nic）以及特异性胆碱能激动剂/拮抗剂处理，以评估TT的重塑情况并揭示潜在的细胞自主性保护机制。研究得出结论：nAChR的激活与ISO诱导的TT损伤减弱相关，表明nAChR信号在限制急性β-肾上腺素能刺激引起的TT重塑中发挥心肌细胞自主性作用，而毒蕈碱型受体可能不参与此过程。

关键技术与方法

研究人员从Sprague-Dawley（SD）大鼠（购自北京维通利华实验动物技术有限公司）中酶解分离心室心肌细胞。使用共聚焦显微镜（Zeiss LSM 710）结合CellMask Deep Red膜染料进行成像，并通过IDL程序对TT网络进行盲法量化分析，包括基于快速傅里叶变换（FFT）的TT功率、单位面积横向元素数量（TEs/S）和纵向元素数量（LEs/S）。统计使用GraphPad Prism 9.5软件进行分析。

研究结果

2.1 ISO诱导分离的成年大鼠心肌细胞中显著的TT紊乱

研究人员首先用ISO处理原代成年大鼠心肌细胞48小时。ISO诱导了显著的TT形态紊乱，表现为横向周期性丧失、纵向TT增多以及稀疏、碎片化的微管结构形成。同时，ISO组的细胞长宽比（L/W）显著降低，提示细胞形态恶化及潜在的功能下降。

2.2 胆碱能受体刺激对TT组织的影响

研究人员用ACh（nAChR和mAChR的内源性配体）、Nic（nAChR激动剂）或呫诺美林（Xano, mAChR激动剂）处理细胞48小时。结果显示，所有三种激动剂单独使用时均改变了相对于对照组的TT功率。ACh或Nic对TEs/S无显著影响，但显著增加了LEs/S，而Xano则无此效应。任何激动剂均未改变细胞L/W比值。这些数据表明，即使是胆碱能信号本身，特别是nAChR的部分激活，也可能影响TT动力学，表现为从横向向纵向组织的转变，而非微管的整体丢失。

2.3 ACh或Nic共激活nAChR与ISO诱导的TT重塑减弱相关

鉴于单独使用ACh或Nic产生了轻微的TT形态变化，研究人员随后评估了它们在交感神经过度刺激下的影响。值得注意的是，ISO与ACh或Nic的联合处理似乎调节了TT的结构完整性，不同程度地减弱了ISO诱导的紊乱。这种效应与横向取向元素密度增加以及紊乱微管轮廓减少相关。在ISO+Xano联合处理组中未观察到这种保护作用。此外，ISO诱导的L/W比值降低在ACh或Nic联合处理组中显示出逆转趋势。

2.4 nAChR介导的TT重塑减弱的药理学证据

为了验证这一效应的特异性，研究人员应用了nAChR拮抗剂六甲溴铵（Hex）。在此条件下，Hex似乎减弱了ACh和Nic对ISO诱导的TT损伤的效应，表明nAChR介导了这一保护性细胞反应。

讨论与结论总结

在讨论部分，研究人员指出，本研究表明TT结构可直接通过肾上腺素能和胆碱能受体（尤其是nAChR）的调节来调控。ACh或Nic与ISO的联合处理似乎调节了TT的取向和密度，并部分减弱了ISO诱导的结构破坏和细胞肥大。可能的解释是，单独激活肾上腺素能和烟碱型胆碱能受体可改变心肌细胞的Ca²⁺稳态——前者通过cAMP介导的Ca²⁺处理蛋白磷酸化，后者作为阳离子通道直接调节胞浆Ca²⁺浓度。ISO和尼古丁联合处理期间TT的矛盾性保护可能源于它们下游信号通路之间的双向负交互作用。一方面，ISO可能激活β-肾上腺素能受体/cAMP/PKA通路以抑制尼古丁的毒性；另一方面，尼古丁可能通过nAChR触发的Ca²⁺内流刺激钙调神经磷酸酶，作为PKA的分子抗衡力量，从而维持胞内Ca²⁺低于钙蛋白酶激活的关键阈值，保护TT完整性。此外，nAChR介导的PI3K/AKT生存信号通路也可能参与其中。从临床转化角度看，虽然非常初步，但这些体外数据提供了一种可能的细胞机制，即胆碱能信号通过烟碱型受体介导的生存信号在应激下调节心肌细胞TT完整性。研究最终强调，需要利用亚型选择性拮抗剂或基因敲除模型来鉴定具体受体亚型，并需采用三维电子显微镜等方法全面评估超微结构变化，以及对JPH2等下游靶蛋白进行机制研究。

研究结论：尽管长期的交感应激（ISO）严重破坏了TT结构和细胞形态，但在这些条件下，通过ACh或Nic共激活nAChR与较不明显的损伤相关。尽管单独使用时引起轻微的TT重塑，但nAChR激活可能作为ISO诱导的结构恶化的潜在拮抗剂。