重复阻断TRPA1通道减轻复发-缓解型多发性硬化小鼠模型的伤害性感受与神经炎症

《International Journal of Molecular Sciences》：Repeated TRPA1 Blockade Reduces Nociception and Neuroinflammation in a Relapsing–Remitting Mouse Model of Multiple Sclerosis

　　

复发-缓解型多发性硬化（relapsing-remitting multiple sclerosis, RRMS）是一种以神经炎症和脱髓鞘为特征的慢性自身免疫性及神经退行性疾病。神经病理性疼痛是常见且管理不佳的症状，与氧化应激密切相关。瞬时受体电位锚蛋白1（transient receptor potential ankyrin 1, TRPA1）可被氧化性介质激活，在复发-缓解型实验性自身免疫性脑脊髓炎（relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis, RR-EAE）模型中参与伤害性信号传导和神经炎症过程。本研究利用RR-EAE小鼠模型，探讨重复药理学阻断TRPA1对伤害性行为及疾病相关病理机制的影响。雌性C57BL/6小鼠在诱导后第16至第36天接受TRPA1拮抗剂A-967079（30 mg/kg，灌胃）治疗。研究人员进行了行为学、分子及生化分析。重复给予A-967079可减轻机械性和冷刺激诱发的异常性疼痛，且不损害运动功能或改变体重。TRPA1拮抗作用调节了胶质细胞标志物表达和血浆促炎性细胞因子水平。A-967079减轻了氧化应激，降低了过氧化氢（hydrogen peroxide, H2O2）、4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal, 4-HNE）、晚期氧化蛋白产物（advanced oxidation protein products, AOPPs）（均为TRPA1内源性激动剂）水平及NADPH-细胞色素c还原酶活性。这些发现表明，重复TRPA1拮抗可有效调节神经病理性疼痛样行为，并靶向与RRMS相关的关键病理机制。该研究方案在疾病发作后、症状已出现时开始治疗，更贴近临床管理实际。研究结果支持TRPA1拮抗作为RRMS疼痛管理的一种有前景的治疗策略。

论文解读：重复TRPA1阻断减轻复发-缓解型多发性硬化小鼠模型的伤害性感受与神经炎症

一、研究背景与目的

复发-缓解型多发性硬化（relapsing-remitting multiple sclerosis, RRMS）是中枢神经系统（central nervous system, CNS）最常见的慢性炎症性脱髓鞘疾病，以症状反复发作与缓解交替为特征，多发于20至40岁女性。神经病理性疼痛是RRMS最令人困扰的症状之一，影响高达63%的患者，表现为机械性和冷刺激异常性疼痛，与氧化应激密切相关。目前一线治疗药物如加巴喷丁、普瑞巴林和度洛西汀疗效有限且常伴不良反应，亟需新型治疗策略。瞬时受体电位锚蛋白1（transient receptor potential ankyrin 1, TRPA1）是一种可被过氧化氢（H₂O₂）、4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal, 4-HNE）和晚期氧化蛋白产物（advanced oxidation protein products, AOPPs）等氧化性内源性介质激活的非选择性离子通道，表达于神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，参与伤害性信号传导和神经炎症。既往研究已证实TRPA1基因敲除小鼠在复发-缓解型实验性自身免疫性脑脊髓炎（relapsing-remitting experimental autoimmune encephalomyelitis, RR-EAE）模型中不出现异常性疼痛和神经炎症，急性给予TRPA1拮抗剂A-967079可减轻伤害性感受及焦虑抑郁样行为。然而，重复TRPA1拮抗对长期神经病理性疼痛样症状和神经炎症的影响尚未被探索。本研究旨在填补这一空白，评估重复给予选择性TRPA1拮抗剂A-967079对RR-EAE模型神经病理性疼痛样症状的治疗潜力。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员使用雌性C57BL/6小鼠（20–30 g，6–8周龄），通过皮下注射MOG_35-55抗原（200 μg）联合Quil A佐剂（45 μg）并腹腔注射百日咳毒素（250 ng，第0天和第2天）诱导RR-EAE模型，对照组仅接受Quil A和百日咳毒素。小鼠被随机分为四组（每组10只）：Control-Veh、Control-A-967079、RR-EAE-Veh和RR-EAE-A-967079。从诱导后第16天至第36天，每日灌胃给予A-967079（30 mg/kg）或溶媒（1% DMSO in 0.9% isotonic saline）。主要技术方法包括：行为学测试（rotarod转棒实验评估运动协调、von Frey纤维丝检测机械性异常性疼痛、丙酮实验评估冷异常性疼痛、旷场实验（open field test）评估自发探索行为、筑巢实验评估自发伤害性感受和动物福利）；分子生物学方法（逆转录定量实时PCR（RT-qPCR）检测脊髓Iba-1、Gfap和Olig-1 mRNA表达）；生化分析（H₂O₂、4-HNE、AOPP水平测定，NADPH-细胞色素c还原酶活性检测）；流式细胞术（BD CBA小鼠Th1/Th2/Th17细胞因子试剂盒定量血浆IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ和IL-17水平）；主成分分析（principal component analysis, PCA）和Spearman相关性分析用于多变量数据整合。

三、研究结果

3.1 重复给予TRPA1拮抗剂A-967079在RR-EAE模型中产生抗伤害性感受效应

通过von Frey纤维丝实验发现，RR-EAE-Veh组小鼠在诱导后第21、28和35天表现出显著的机械性异常性疼痛，而A-967079治疗在第28天（p = 0.0054）和第35天（p = 0.0002）显著减轻了这种机械性痛觉过敏。丙酮实验显示，RR-EAE-Veh组在所有评估时间点均表现出冷敏感性增加，A-967079治疗在第28天（p = 0.0015）和第35天（p = 0.0015）显著减轻了冷异常性疼痛。此外，RR-EAE小鼠筑巢行为显著受损（p < 0.0001），A-967079治疗显著改善了筑巢评分（p < 0.0001），恢复至接近对照组水平。

3.2 旷场实验显示RR-EAE动物行为活动改变，TRPA1拮抗改善这些行为

旷场实验中，各组在穿越次数和总运动距离上无显著差异，表明RR-EAE诱导和A-967079治疗未损害基础运动功能。然而，RR-EAE-Veh组在第21天和第34天的站立（rearing）、理毛（grooming）和嗅探（sniffing）行为显著减少，A-967079治疗在第21天和第34天均显著增加了这三种自发探索行为。rotarod实验和体重监测显示各组间无显著差异，进一步确认了运动功能未受损害。

3.3 重复A-967079治疗显著调节RR-EAE模型诱导的神经炎症和氧化应激改变

RT-qPCR结果显示，RR-EAE-Veh组脊髓中Iba-1（小胶质细胞标志物）和Gfap（星形胶质细胞标志物）mRNA表达显著升高，而A-967079治疗显著降低了这两种胶质标志物的表达。同时，RR-EAE-Veh组Olig-1（少突胶质细胞转录因子1）mRNA表达显著降低，A-967079治疗显著恢复了其表达水平。生化分析显示，RR-EAE-Veh组脊髓中H₂O₂、4-HNE和AOPP水平以及NADPH-细胞色素c还原酶活性均显著升高，血浆AOPP水平也显著增加；A-967079治疗显著降低了所有这些氧化应激标志物。细胞因子分析显示，RR-EAE诱导显著升高了血浆促炎性细胞因子IL-2、IL-6、IL-17、IFN-γ和TNF-α水平，A-967079治疗显著降低了这些促炎性细胞因子水平，同时显著升高了抗炎性细胞因子IL-10水平。

3.4 重复拮抗剂治疗在RR-EAE模型中效应的主成分分析（PCA）

PCA分析识别出17个主成分，其中PC1和PC2具有统计学显著性，累积解释了80.45%的总方差。PC1（71.75%方差）与冷刺激反应（r = 0.945）、血浆TNF-α（r = 0.927）、脊髓4-HNE（r = 0.925）、血浆IL-6（r = 0.891）、血浆IL-17（r = 0.889）、脊髓AOPP（r = 0.861）、血浆IL-2（r = 0.861）和脊髓NADPH-细胞色素c还原酶活性（r = 0.836）呈正相关，而与von Frey反应（r = ?0.970）、理毛（r = ?0.898）、站立（r = ?0.898）和嗅探（r = ?0.843）呈负相关，提示PC1捕捉了冷刺激反应与氧化应激和促炎标志物之间的多变量关联轴。PC2与血浆IL-10（r = 0.698）、筑巢行为（r = 0.460）和血浆IL-2（r = 0.432）呈正相关。相关性矩阵显示血浆IL-2与IL-6、IL-17和TNF-α正相关，IL-6与IL-2、TNF-α和脊髓4-HNE相关，表明炎症与CNS氧化改变之间存在关联。

四、讨论与结论

讨论部分指出，重复A-967079给药从免疫后第21天起产生稳健且持续的抗伤害性感受效应，与既往急性TRPA1拮抗研究结果一致，并进一步证明重复药理学阻断在疾病进展过程中维持疗效。A-967079改善筑巢行为提示对自发疼痛相关行为的有益作用。旷场实验中站立、理毛和嗅探行为的改善表明TRPA1调节不仅影响伤害性感受，还影响疾病相关的自发行为改变。TRPA1阻断减轻了胶质标志物表达、氧化应激标志物和促炎性细胞因子水平，同时升高IL-10，提示其调节中枢神经炎症和氧化还原依赖性伤害性机制。机制上，TRPA1阻断可能通过阻止持续的Ca²⁺内流，抑制Ca²⁺依赖性酶（如NADPH-细胞色素c还原酶）活性和NF-κB转录通路，从而打破神经炎症与氧化应激的正反馈循环。研究局限性包括RT-qPCR样本量较小（每组3只）、仅评估单一拮抗剂和单一剂量、未进行药代动力学和药效学参数评估、未进行免疫组化或组织学分析以直接评估胶质反应性和髓鞘完整性、未直接评估Ca²⁺信号和NF-κB通路、未纳入雄性动物。

结论部分翻译：在本研究中，RR-EAE模型的诱导再现了临床相关的伤害性行为，如机械性/冷异常性疼痛和自发性伤害性感受，且未引起运动缺陷。该动物模型还表现出与RRMS患者症状一致的病理特征，包括髓鞘标志物表达降低、小胶质细胞和星形胶质细胞活化，以及炎症和氧化应激标志物增加。重复给予TRPA1拮抗剂在36天实验方案中产生稳健且持续的抗伤害性感受效应，且未引起运动损伤或明显不良效应。这一药理学特征使实验模型更接近慢性治疗场景，更符合RRMS患者疼痛管理的临床实际。除伤害性感受缓解外，TRPA1拮抗还调节疾病病理生理的中枢组分，减少胶质细胞活化、神经免疫炎症和氧化应激。综上所述，这些发现表明TRPA1在RR-EAE模型相关神经病理性疼痛样疼痛的发展和维持中发挥重要作用，支持该通道作为开发MS相关疼痛管理新药理学策略的有前景的治疗靶点。然而，仍需进一步临床前研究评估不同TRPA1拮抗剂、多种给药方案、两种性别和互补实验模型，以验证这些发现并支持其临床转化潜力。