《International Journal of Molecular Sciences》：Quantitative Bioluminescent Imaging of AHR Activity Using a Thermostable Variant of the Fungal Luciferase nnLuz
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生物发光报告系统是生物医学研究中的重要工具。以转基因形式表达或插入内源性基因组的荧光素酶（luciferase）可用于通过微创实验可视化分子事件。然而，该反应需要添加底物荧光素（luciferin）。同时表达荧光素酶并产生荧光素、具有自持发光（self-sus
生物发光报告系统是生物医学研究中的重要工具。以转基因形式表达或插入内源性基因组的荧光素酶（luciferase）可用于通过微创实验可视化分子事件。然而，该反应需要添加底物荧光素（luciferin）。同时表达荧光素酶并产生荧光素、具有自持发光（self-sustained luminescence）的生物体，将允许持续、便捷且经济地获取生理信息。Neonothopanus nambi真菌生物发光通路已被以此方式利用，以产生自发光植物（autoluminescent plants）。然而，向哺乳动物模型推进受到野生型真菌荧光素酶（nnLuz）温度敏感性的阻碍。研究人员通过构建内源性Cyp1a1表达的报告系统作为芳烃受体（AHR）激活的度量，在生理相关水平上测试了nnLuz热稳定变体（nnLuz_v3）的体内效力。先前发表的Cyp1a1-Fluc小鼠使研究人员能够比较新型荧光素酶nnLuz_v3与已建立的萤火虫荧光素酶（Fluc）。在Cyp1a1-nnLuz_v3小鼠中，生物发光信号足够稳定，可在标准体内成像设备和消费级相机上捕获分辨良好的发光图像。这些结果降低了nnLuz_v3作为体内分子报告系统使用的风险，同时为AHR药物发现和研究提供了一种新工具。
研究背景与问题：生物发光报告系统（bioluminescent reporters）是生物医学研究中可视化分子事件的重要工具。动物体内荧光报告受组织自发荧光和激发光递送限制，而生物发光背景信号低；但现有荧光素酶（luciferase）系统通常需外源添加荧光素（luciferin），导致成像侵入、不连续、成本高且底物组织分布不均。自持发光（self-sustained luminescence）需同时表达荧光素酶和产生荧光素，有望持续、便捷、经济地获取生理信息。Neonothopanus nambi真菌生物发光通路已用于自发光植物，但温血动物应用受野生型真菌荧光素酶（nnLuz）温度敏感性限制；前期在37 °C哺乳动物细胞中，含T99P、T192S和A199P替换的热稳定变体nnLuz_v3优于野生型，但转基因动物体内是否有效尚不清楚。研究人员因此以芳烃受体（AHR）激活为模型，构建内源性Cyp1a1（细胞色素P450 1a1）表达报告小鼠，评估nnLuz_v3在生理相关表达水平下的体内报告效能，并与既往Cyp1a1-Fluc（萤火虫荧光素酶）小鼠比较。结论是nnLuz_v3在体内产生可检测、较稳定的生物发光，可用于标准设备和消费级相机成像，降低其作为体内分子报告系统的风险，并为AHR药物发现提供新工具，推动自发光哺乳动物模型优化。
主要技术方法：研究人员用CRISPR/Cas9同源重组在E14小鼠胚胎干细胞（mESC，ATCC CRL-1821）中将IRES2-nnLuz_v3-T2A-iRFP670敲入Cyp1a1 3′UTR，筛选克隆A4并建Cyp1a1-nnLuz_v3小鼠；Cyp1a1-Fluc小鼠由OzGene生成，为既往报道品系；HEK293T（ATCC CRL-3216）用于通路自主发光及基因滴定。体内成像用IVIS Spectrum，部分用消费级Sony Alpha 1；以500–700 nm、20 nm带通滤光片测发射光谱；RT-qPCR测Cyp1a1、Cyp1b1和Tbp；统计用ANOVA及Dunnett或?idàk多重比较。
研究结果：
1. 内源性AHR活性nnLuz_v3报告系统的构建与表征。将nnLuz_v3-T2A-iRFP670插入Cyp1a1 3′UTR，IRES2驱动独立翻译，T2A分隔；mESC克隆经FICZ（6-formylindolo[3,2-β]carbazole）处理后发光，克隆A4用于建鼠；转基因小鼠发育正常、无明显表型差异；3-mC（3-methylcholanthrene）预处理后，腹腔注射真菌荧光素呈剂量依赖发光，亮度足以在50兆像素消费级相机成像；注射后1 h无明显表型变化，Cyp1a1/Cyp1b1 mRNA未显著改变，提示未激活或抑制经典AHR信号；0.15 mg/g时肺内轻度非显著升高，建议作为未来实验上限；尚不能排除延迟AHR激活或重复暴露毒性。结论：nnLuz_v3可报告内源AHR活性，短期未见明显表型变化。
2. nnLuz_v3与Fluc作为AHR活性体内报告系统的比较。腹腔注射底物后，Fluc发光15 min达峰后衰减，nnLuz_v3峰较慢但更持久；D-luciferin的t
1/2为30.7 min，真菌荧光素为116.8 min；90 min内总辐射量相当；离体肺、肝、肠强发光，与Cyp1a1-Fluc既往结果对应。结论：nnLuz_v3适用于体内内源报告，但因底物性质不同不能直接比较两种荧光素酶。
3. nnLuz_v3体内发射光谱特征。Fluc在体内约620 nm单峰；nnLuz_v3在520 nm主峰并伴约620 nm小峰；离体多数组织绿光，肺呈520/620 nm双峰；绿色点击甲虫荧光素酶小鼠有类似结果，而Cyp1a1-Fluc组织为单峰；提示双峰非真菌发光化学或Cyp1a1表达特异，可能为绿色发光荧光素酶体内伪影，与血红蛋白吸收绿光有关，肺中血红蛋白丰富。结论：nnLuz_v3具有绿移发射光谱特征。
4. 真菌荧光素口服生物利用度。口服灌胃后8 min即见腹部发光；信号强度和分布不同于腹腔注射，主要位于肠道，肺、心、肝信号低，可能因消化道滞留；短期暴露未见毒性或经典AHR信号激活，但对肠上皮的长期影响未知；提示自发光模型的潜在优势。结论：口服途径可行但组织分布受限。
5. 哺乳动物细胞中真菌荧光素生物合成通路的初步优化。HEK293T细胞转染全部通路成员（用较亮的nnLuz_v4）可检测到发光，但比外源添加荧光素低约1000倍，不适于体内成像；添加caffeic acid、hispidin或oxyluciferin显著提高信号；基因滴定显示HispS（hispidin synthase）为限速步骤。结论：通路可在哺乳动物细胞中进一步优化，HispS是关键靶点。
讨论总结：AHR为可结合多种环境、饮食和微生物刺激的转录因子；无配体时滞留胞质，配体结合后转核，与ARNT二聚激活靶基因，Ahrr负反馈。AHR与多种疾病相关，抑制剂已进入实体瘤临床试验，非侵入性AHR报告模型有治疗开发价值。与既往Cyp1a1-Fluc相比，Cyp1a1-nnLuz_v3有三个潜在优势：腹腔注射后发光峰更宽，可能实时观察AHR快速变化；绿移发射光谱和底物需求不同，可与其他生物发光模型杂交，同时观察肿瘤生长、特定细胞浸润或其他基因表达；优化荧光素合成通路后有望成为自发光AHR报告。自发光模型可简单拍照获得实时生理信息，减少侵入，并可拆分通路研究宿主-微生物互作；Neonothopanus nambi通路因无细菌系统中间体毒性而具前景；但哺乳动物细胞全通路发光仍低，需优化，HispS限速，可通过强启动子、多拷贝、不同启动子、密码子多样化或其他真菌同源物提升。
研究结论翻译：总之，研究人员描述了一种可视化AHR活性的新工具，同时验证了真菌荧光素酶nnLuz_v3可用于温血动物体内成像，为建立具有自持真菌生物发光的哺乳动物模型提供了有希望的重要一步。Cyp1a1-nnLuz_v3小鼠健康，AHR激活时显示强生物发光信号。Cyp1a1-nnLuz_v3小鼠与既往描述的Cyp1a1-Fluc动物在发光分布和强度上相当，且真菌荧光素酶相对Fluc具有一些可用于未来AHR研究的独特优势。
