外源硝普钠通过茉莉酸与钙信号相关转录重编程促进夏枯草幼苗迷迭香酸和熊果酸积累

《International Journal of Molecular Sciences》：Trichoderma-Synthesized Iron Oxide Nanoparticles Confer Vanadium Tolerance in Rice Through Multiple Defense Responses

　　

夏枯草（Prunella vulgaris L.）是一种在亚洲和欧洲广泛栽培和利用的珍贵药食兼用经济作物。尽管已知外源硝普钠（SNP，一种一氧化氮（NO）供体）可提高该植物中生物活性多酚和三萜类的生物合成，但其精确调控网络仍不清楚。本研究整合生理学和转录组学分析，解析外源硝普钠（SNP，100 μM）在处理后2、24和48 h如何重编程夏枯草幼苗叶片的次生代谢。结果表明，SNP处理显著改变抗氧化和氧化还原响应，提高渗透调节物质，增加关键生物活性化合物（如迷迭香酸和熊果酸）的积累，并伴随体外抗氧化活性增强。处理后24 h，比较分析鉴定出4341个差异表达转录本（DETs）。外源SNP处理与植物激素信号转导、Ca²⁺信号和次生代谢物生物合成相关。SNP处理显著提高内源茉莉酸（JA）水平，上调核心转录因子（MYBs、bHLHs、WRKYs和NACs）的表达，同时提高JA生物合成转录本（如PvLOXs、PvAOC和PvACX）、参与多酚生物合成的关键转录本（如PvPAL、PvTAT和PvRAS）以及三萜类生物合成关键转录本（如PvHMGS、PvDXS和PvSQS）的表达。研究人员的发现提供了SNP与夏枯草次生代谢变化相关的生理、激素和转录响应的系统视图，并为未来叶面喷施SNP以提高药用品质的研究提供理论基础。

研究背景与意义：夏枯草（Prunella vulgaris L.）是亚洲和欧洲广泛利用的药食兼用植物，其幼苗叶可作蔬菜，全草用于功能性茶饮和药材，中国年市场需求约5000–10000吨，人工栽培成为缓解供需矛盾的主要方式。林下生态栽培是中药农业的重要模式，夏枯草对弱光林下环境具有适应性，适度遮阴可提高多种药用植物产量和活性成分。研究人员前期发现，UV-B、遮阴、干旱和土壤养分缺乏等非生物胁迫可通过过氧化氢（H₂O₂）、水杨酸（SA）和茉莉酸甲酯（MeJA）等信号促进夏枯草多酚和三萜积累；初步观察显示中度弱光下夏枯草穗内源一氧化氮（NO）和迷迭香酸（RA）含量升高，75%遮阴较全光照使叶片NO含量提高约20.1%，RA和熊果酸（UA）分别提高138.9%和15.6%。但外源SNP调控夏枯草次生代谢的分子级联，尤其与JA、SA、IAA等激素途径及PvRAS、PvTAT、PvDXS等关键转录本的互作仍不清楚，限制林下栽培技术优化和大规模应用。因此，研究人员以100 μM SNP处理夏枯草幼苗叶片，整合生理和转录组分析，阐明其多酚和三萜生物合成响应，为叶面SNP应用和夏枯草林下生态栽培提高药材品质提供理论基础。

关键技术方法：样本队列来源为2023年6月采自四川省广元市昭化区射箭镇（32.25° N，105.43° E）的成熟夏枯草种子，经成都医学院陈宇航教授鉴定，试验在成都医学院药用植物园（30.82° N，104.20° E，海拔445.4 m）进行，2024年6月10日叶面喷施100 μM SNP。关键技术包括生理生化试剂盒测定NO、H₂O₂、抗氧化酶及渗透调节指标；UHPLC–MS/MS测定JA、SA和IAA；HPLC测定RA和UA；分光光度法测定总酚酸、总三萜和总黄酮；DPPH和ABTS评价体外抗氧化能力；PacBio Sequel IIe全长转录组测序结合Illumina NovaSeq 6000校正，DESeq2鉴定DETs，GO/KEGG富集、iTAK预测转录因子，RT-qPCR验证。

研究结果：2.1.1 NO和H₂O₂含量及抗氧化系统：通过试剂盒和转录组热图发现，SNP处理提高叶片NO含量，降低H₂O₂含量，提高SOD、CAT和APX活性及GSH含量，AsA后期升高，POD在24和48 h下降，CAT、APX和GST相关转录本上调。2.1.2 可溶性糖、可溶性蛋白、MDA和Pro含量：通过生理指标测定发现，SNP提高可溶性糖、MDA和Pro含量，可溶性蛋白先降后升，表明渗透调节和膜脂过氧化响应并存。2.1.3 PAL和PPO活性：通过酶活测定发现，PAL活性在2和24 h升高、48 h下降，PPO活性在2–48 h持续升高。2.1.4 植物激素水平及代谢相关转录本：通过UHPLC–MS/MS和转录组发现，SNP提高JA含量、降低IAA含量，SA无显著变化；JA合成转录本上调，COI1下调、JAZ上调，IAA合成相关TAA1、YUCCA和ALDH转录本下调。2.1.5 次生代谢物含量及其生物合成转录调控：通过HPLC、分光光度法和转录组发现，SNP提高RA、UA、总酚酸、总三萜和总黄酮含量；苯丙烷/RA通路PvPAL、PvC4H、Pv4CL、PvTAT和PvRAS上调；MEP通路PvDXS、PvHDS、PvHDR上调，MVA通路PvHMGS上调、PvHMGR下调，PvSQS和PvSQE上调，Pvβ-AS下调。2.1.6 体外抗氧化能力：通过DPPH和ABTS实验发现，SNP处理在24和48 h降低IC50值，增强叶片乙醇提取物体外抗氧化能力。2.2.1 转录组测序和组装：通过PacBio Sequel平台获得353,897条polymerase reads、50.45 Gb原始数据、298,991条CCS reads和280,786条FLNC reads，校正后获得30,160条高置信非冗余转录本。2.2.2 DETs分析：通过DESeq2鉴定出4341个DETs，其中2569个上调、1772个下调；GO和KEGG富集显示次生代谢物生物合成、苯丙烷生物合成、萜类骨架生物合成、植物–病原互作和植物激素信号转导等通路显著富集。2.2.3 转录因子表达谱：通过iTAK预测发现295个差异表达转录因子，隶属54个家族，主要包括MYB-related、MYB、bHLH、WRKY和NAC等。2.2.4 RNA-Seq数据的RT-qPCR验证：通过21个DETs的RT-qPCR验证发现，其表达趋势与RNA-Seq一致，支持测序数据可靠性。

讨论总结：讨论指出，外源SNP作为NO供体提高夏枯草叶片内源NO，降低H₂O₂并增强SOD、CAT、APX、GSH/GST和AsA相关抗氧化防御；MDA和Pro升高反映膜脂过氧化与渗透调节响应，可溶性糖和可溶性蛋白动态变化参与细胞稳态维持。PAL和PPO活性变化与酚类代谢及防御响应相关。SNP处理提高JA含量并上调JA合成转录本，COI1下调和JAZ上调提示JA信号反馈调节；IAA降低与IAA合成转录本下调及酚类积累相关，SA水平稳定。RA和UA积累与苯丙烷/RA通路及MEP/MVA通路关键转录本上调一致，总酚酸、总黄酮和总三萜增加与相应生物合成转录本上调及Ca²⁺信号相关。DPPH和ABTS抗氧化能力增强与多酚和三萜积累相关。DETs富集于次生代谢、激素信号和植物–病原互作通路，CNGC和CDPK转录本变化提示Ca²⁺信号参与。MYB、bHLH、WRKY和NAC等转录因子与酚类和三萜合成转录本共上调，可能参与调控，但原文指出仍需直接功能验证。

研究结论部分翻译：总体而言，整合生理与转录组分析表明，外源SNP处理在2–48 h处理期内诱导夏枯草幼苗叶片产生生理响应。首先，SNP显著改变抗氧化与氧化还原响应，提高渗透调节物质含量，并促进多酚类和三萜类化合物（如RA和UA）积累，同时伴随体外抗氧化能力增强。其次，在处理后24 h，CK与SNP处理组间鉴定出4341个DETs。SNP处理与植物激素信号转导、Ca²⁺信号及次生代谢物生物合成相关。第三，SNP处理显著提高内源JA水平，上调核心转录因子（MYBs、bHLHs、WRKYs和NACs）表达，同时上调JA生物合成转录本及参与多酚和三萜类生物合成的关键结构转录本。基于这些发现，未来研究将聚焦其他胁迫相关信号分子（如H₂O₂和Ca²⁺）的分子过程，这些信号可能与SNP诱导信号协同或共同精细调控次生代谢。此外，研究人员旨在阐明涉及关键TFs（如MYBs、bHLHs、WRKYs和NACs）的上游调控级联，并探索小非编码RNA（miRNAs）在多种非生物胁迫条件下介导多酚和三萜类生物合成转录后调控的潜在作用。本研究为外源SNP调节夏枯草幼苗叶片次生代谢物产生的生理和转录响应提供了有价值见解，并可能为未来田间研究SNP应用和林下生态栽培以提高这一珍贵药食兼用植物品质提供理论基础。