《Biomolecules》：Dynamic Changes in the Urinary Proteome of Normal Pregnant Mice Carrying Phenylketonuria-Affected Fetuses
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苯丙酮尿症（Phenylketonuria，PKU）是一种由苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase，PAH）基因致病变异引起的常染色体隐性遗传病。临床上，母源性PKU综合征——即受累母亲表现为高苯丙氨酸血症——可在妊娠期间导致胎儿不
苯丙酮尿症（Phenylketonuria，PKU）是一种由苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase，PAH）基因致病变异引起的常染色体隐性遗传病。临床上，母源性PKU综合征——即受累母亲表现为高苯丙氨酸血症——可在妊娠期间导致胎儿不可逆的神经损伤。然而，由代谢正常的母体携带内在PKU胎儿时，胎儿是否会在母体尿液中引发可测量的分子变化，目前尚不清楚，且针对该情景的非侵入性产前监测方法仍然缺乏。本研究中，研究人员将Pah+/?雌性小鼠分别与Pah+/?雄性小鼠及野生型雄性小鼠交配。在妊娠第1天至第19天共10个时间点纵向采集孕鼠尿液样本。采用数据非依赖采集（data-independent acquisition，DIA）定量蛋白质组学，结合GO/KEGG分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）以及LASSO-随机森林双策略方法筛选候选生物标志物。结果表明，组特异性蛋白质组信号最早在第1天即可检测到，少量差异表达蛋白在整个妊娠期持续存在并表现出时间动态特征。置换检验显示，该差异蛋白组合随机产生的概率较低（0.04–0.06），提示其并非随机产生。两种机器学习筛选策略的交集鉴定出5种蛋白：GINM1、PRG4、LY6A、NTM和YIPF3。基于GLO1的显著差异表达及其在蛋白共表达网络中的核心地位，进一步将其纳入候选生物标志物，最终共获得6种候选生物标志物。本研究发现，母体尿液蛋白质组可非侵入性地反映胎儿内在PKU所诱导的母体系统性反应。
论文解读
一、研究背景与目的
苯丙酮尿症（Phenylketonuria，PKU）是一种由苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase，PAH）基因变异引起的常染色体隐性遗传性氨基酸代谢疾病，1934年由挪威医师Asbj?rn F?lling首次报道。其核心发病机制为PAH活性丧失，苯丙氨酸（Phe）无法正常转化为酪氨酸，导致体内大量蓄积并产生神经毒性代谢产物，若未及时治疗可造成不可逆的神经损伤，临床多表现为智力障碍和神经功能缺陷。PKU在新生儿中发病率最高，美国新生儿发病率约为每10万例5.3–7.4例，欧洲约为万分之一。
当前临床PKU防控体系主要依赖产后新生儿筛查和饮食干预治疗，尚缺乏成熟的产前功能性诊断方法。现有不足体现在三个方面：其一，新生儿筛查仅能实现产后诊断，而胎儿期神经损伤已经发生，错失宫内干预窗口；其二，传统基因检测仅能检出突变位点，无法评估残余酶活性或真实代谢表型，存在基因型-表型分离现象，难以区分轻型和重型亚型并指导个体化早期干预；其三，无法识别由母胎异常互作引起的继发性胎儿源性PKU损伤。因此，开发胎儿PKU的非侵入性生物标志物是实现早筛查、早诊断、早干预的关键突破口。
本研究利用表型正常的Pah+/?孕鼠产生Pah?/?纯合PKU受累胎儿，排除了母体内在效应，特异性模拟Pah缺陷胎儿情景。通过分析孕鼠母体尿液，旨在捕捉病理性胎儿在母胎界面引发的系统性母体分子反应，并追踪整个妊娠期尿液蛋白质组的动态变化。
二、主要技术方法
研究人员选用15只野生型C57BL/6J雄性小鼠、15只Pah+/?杂合雄性小鼠和30只Pah+/?杂合雌性小鼠（购自上海南方模式生物科技股份有限公司，动物许可证号SCXK（北京）2024-0003），建立实验组（PKU-D：Pah+/?雌鼠×Pah+/?雄鼠，可产生PKU胎儿）和对照组（C-D：Pah+/?雌鼠×野生型雄鼠，不产生PKU胎儿）。在妊娠第1天至第19天共10个时间点，使用代谢笼过夜收集孕鼠尿液。对尿液样本进行蛋白提取、酶解后，采用纳升液相色谱联用Orbitrap Exploris 480高分辨质谱进行数据非依赖采集（DIA）定量蛋白质组学分析，以Swiss-Prot小鼠数据库进行检索。生物信息学分析包括GO/KEGG功能富集分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）、LASSO惩罚逻辑回归与随机森林双策略联合筛选、置换检验、STRING蛋白互作网络分析及Mfuzz时间序列聚类等。
三、研究结果
3.1 子代基因分型结果
通过1%琼脂糖凝胶电泳对PKU-D和C-D组子代进行基因分型。野生型（WT）扩增片段为380 bp，杂合型（HE）同时显示380 bp和644 bp两条条带，纯合型（HO）仅显示644 bp条带。结果显示实验组子代中WT、HE、HO三种基因型均可检出，对照组子代仅检出WT和HE，未观察到HO个体。每只实验组孕鼠的窝产仔中至少有一只HO（Pah?/?）胎儿，满足研究设计的核心要求。
3.2 子代表型鉴定结果
HO小鼠毛色明显变浅呈灰色，与酪氨酸供应不足和黑色素合成受损相关。体重方面，HO小鼠从6周龄起即表现出生长迟缓，在6至24周龄每个测量时间点的体重均显著低于WT和HE小鼠，而WT和HE小鼠之间无显著差异。毛色变浅和生长迟缓与PKU模型小鼠的特征性表现一致。
3.3 蛋白质组学结果
3.3.1 模型构建与样本采集
两组孕鼠的妊娠率和总妊娠时长无显著差异。对照组成功交配12对，实验组成功交配10对，实验期间未发生流产或孕鼠死亡。
3.3.2 妊娠期尿液蛋白质组整体变化
共收集218份尿液样本（实验组n=10，对照组n=12），鉴定出2591种蛋白（FDR<1.0%），平均每样本1128种蛋白。经质量控制筛选后，202份样本用于后续分析。
3.3.3 质谱平台质量控制
板内质控样本QC1–QC3的蛋白水平中位变异系数（CV）分别为31.2%、48.5%和15.7%，绝大多数蛋白的CV低于50%。QCmix重复样本间Pearson相关系数为0.89–0.97，表明DIA蛋白质组学检测系统技术重复性可靠。
3.3.4 不同妊娠时间点差异蛋白分布
各时间点上调和下调差异蛋白数量呈现强烈的时间波动：妊娠早期以下调蛋白为主；随妊娠进展，下调蛋白数量逐渐减少；第9天之后上调蛋白占主导，第19天上调蛋白数量达峰值。UpSet交集分析显示大多数差异蛋白为单时间点特异性变化，仅少数蛋白在多个妊娠阶段共同差异表达，表明胎儿源性PKU引起的母体扰动具有高度时间动态性。
3.3.5 置换检验验证差异蛋白可靠性
对每个时间点的差异蛋白进行随机组合模拟。10个时间点中有9个（第1、3、5、7、11、13、15、17、19天）的随机产生概率极低（0.04–0.06），表明大多数时间点的差异蛋白组合并非随机产生，具有统计学显著性和潜在生物学相关性。
3.3.6 PKU差异蛋白的时间检测特征
共鉴定45种关键PKU蛋白（9种直接相关+36种强相关）。第1天检出BH4再生循环关键酶PCBD1及显著上调的TTR；第3天检出以L-苯丙氨酸为底物的氨基酸转运体SLC6A14；第5天以GST家族、GGCT、SHMT1等代谢酶为主；第7天起乙二醛酶/谷胱甘肽解毒系统（GLO1、HAGH/GLO2）和线粒体呼吸链蛋白（UQCRC1、COX5B）成组出现；第9天首次检出PAH，伴随泛素-蛋白酶体/ERAD组分集中激活；第11天为抗氧化网络最密集时间点，AADC/DDC、GCLM、SOD2、NQO1同时检出；第13天以线粒体能量代谢簇（ACADVL、UQCRC1、COX5B）和FSTL1为特征；第15天髓鞘溶酶体脂质代谢酶GALC、ARSA及叶酸-甲硫氨酸循环酶MTR、MTHFD1集中出现；第17天检出内质网糖蛋白质量控制酶UGGT1；第19天再次检出PAH，同时出现pterin家族双功能蛋白Gephyrin和PLP合酶PNPO。另有23种蛋白在≥3个时间点组间稳定特异性检出（如NUA、C9、ECM1、PRG4），其功能涉及氧化应激、免疫炎症、髓鞘损伤、神经发育和蛋白稳态。
3.3.7 KEGG通路与蛋白互作网络
样本相关性热图显示组内高相关性和组间显著分离。KEGG富集显示差异蛋白主要富集于代谢、免疫吞噬、神经退行性疾病相关通路、信号转导和细胞黏附。苯丙氨酸代谢和酪氨酸代谢通路在妊娠中晚期显著富集。ROS和氧化磷酸化通路显著富集。突触囊泡循环及阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病等神经退行通路显著富集。STRING蛋白互作网络中，14种关键PKU差异蛋白（SOD2、TTR、SHMT1、UQCRC1、GCLM、COX5B、MTHFD1、GLO1、ARSA、FSTL1、KL、GALC、SLPI、DDC等）作为核心形成互作模块。Mfuzz将差异蛋白分为6个趋势簇，如簇4（D9达峰，含TTR）对应甲状腺素转运，簇6（D5低谷，含PCBD1）对应pterin再生。
3.3.8 WGCNA共表达网络分析
基于1247种log2转换蛋白构建无标度共表达网络，鉴定出5个模块：棕色（149）、绿松石色（678）、黄色（148）、蓝色（229）和绿色（24）。模块-表型关联分析显示，棕色模块与PKU-D显著正相关（r=0.708，p=7.7×10?32），绿松石色模块在PKU-D中升高（r=0.278，p=6.4×10?5）；黄色（r=?0.483）和蓝色（r=?0.267）模块与C-D相关；绿色模块无显著关联。无模块与妊娠天数显著相关，表明共表达变化主要由PKU胎儿驱动而非妊娠进程本身。棕色模块富集SOD2、GLO1、NQO1、Klotho、SHMT1等氧化应激/代谢蛋白，在PKU-D整个妊娠期持续高表达。GO-BP时间富集分析显示氧化应激-谷胱甘肽、突触信号、免疫应答和蛋白降解通路在妊娠中晚期逐渐富集。
3.3.9 LASSO与随机森林双策略筛选候选生物标志物
早期阶段特异性筛选（第1–5天，n=64）：LASSO（lambda.1se=3.393）选出25种候选蛋白，与随机森林Top50交集获得12种早期核心蛋白，其中GINM1（Q91WR6）在两种算法中均排名第一。该模型在妊娠早期（第1–5天）AUC达1.000，中期为0.844–0.960，晚期下降，显示明确的早期窗口特异性。
跨时间点通用筛选（第1–19天，n=202）：LASSO（lambda.1se=0.0373）选出38种候选蛋白，与随机森林Top50交集获得15种跨时间点核心蛋白。两种策略产生5种重叠蛋白：GINM1、PRG4、LY6A、NTM和YIPF3。其中GINM1、PRG4、YIPF3和LY6A同时为WGCNA网络中的hub蛋白（kME分别为0.690、0.666、0.501和0.69）。GLO1作为差异表达蛋白和核心hub蛋白被进一步纳入，其为乙二醛酶系统关键限速酶，介导甲基乙二醛解毒和氧化应激反应。NTM虽非模块hub蛋白，但作为IgLON家族神经细胞黏附分子，参与神经发育和突触形成，可能与PKU胎儿神经发育紊乱相关。最终确定6种候选生物标志物。
3.3.10 候选生物标志物与PKU机制蛋白关联验证
对6种候选蛋白与14种PKU相关功能蛋白（氧化应激：SOD2、GPX1、CAT；乙二醛酶/羰基解毒：HAGH、GLO1；BH4-苯丙氨酸代谢：PAH、PCBD1、SPR、QDPR；神经代谢/内质网应激：TTR、ENO1、MTHFD1、GALC、HSPA5）进行STRING互作预测和Spearman相关分析。STRING网络鉴定GLO1为枢纽节点（degree=9），连接乙二醛酶介导的羰基解毒、氧化应激和BH4代谢通路。GLO1与多数PKU相关功能蛋白呈显著正相关（r=0.32–0.63）。其余5种候选蛋白与PKU相关功能蛋白未检出直接物理互作，主要表现为协同表达变化，提示潜在的间接调控关系。
四、讨论与结论
研究人员提出假设性病理级联：“苯丙氨酸蓄积→一碳代谢/BH4失衡→氧化应激增强→神经递质合成受损”。但需注意，尿液蛋白质组数据仅能证明分子关联，不能建立因果关系或通路通量。6种候选生物标志物在妊娠早期即表现出显著组间差异，随妊娠进展而减弱，符合早期筛查目标。GLO1兼具候选生物标志物和机制蛋白双重角色，支持甲基乙二醛-AGE-神经毒性轴的核心地位。
本研究存在以下局限性：第一，所有实验均在小鼠模型中进行，结果不能直接外推至人类妊娠；第二，分组以整窝胎儿基因型定义，受限于样本量，无法评估尿液蛋白质组变化与每只孕鼠携带HO胎儿数量的相关性；第三，仅进行了蛋白质组学分析，未定量检测苯丙氨酸及其代谢产物；第四，LC-MS/MS检测的是酶解肽段而非完整天然尿蛋白；第五，早期预测模型AUC接近1.000，存在过拟合风险，需在大型独立队列中进行外部验证。
研究结论：对全妊娠期母体尿液的差异蛋白质组分析揭示了携带PKU胎儿孕鼠中规律、可重复且动态的蛋白质组变化。置换检验显示10个时间点中9个的随机产生概率较低（0.04–0.06），表明差异蛋白组合非随机且具有统计学意义。功能富集揭示了从妊娠早期pterin代谢/氨基酸转运向中晚期氧化应激和髓鞘重塑的时间性反应转变。WGCNA显示母体反应的模块化组织，KEGG和STRING分析揭示苯丙氨酸-一碳代谢-氧化应激的协同反应。双策略筛选确定5种核心候选标志物——GINM1、PRG4、LY6A、NTM和YIPF3，兼具早期特异性和跨时间点稳定性；纳入GLO1后共获得6种候选生物标志物，并建立了候选标志物-机制关联。这些发现为基于母体尿液蛋白质组的PKU非侵入性妊娠早期筛查提供了概念验证和候选生物标志物基础。
