生物工程化H2O2缓释ROS凝胶对多重耐药金黄色葡萄球菌的双重抗菌与免疫调节作用

《Biomolecules》：Dual Antimicrobial and Immunomodulatory Activities of a Bioengineered Reactive Oxygen Species Releasing Gel Against Multidrug-Resistant Staphylococcus aureus

　　

在本研究中，研究人员评估了一种新型生物工程化活性氧（ROS）凝胶的抗菌和免疫调节特性，该凝胶在水合后可持续释放低浓度过氧化氢（H₂O₂）。研究人员针对一株多重耐药临床分离的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）评估了ROS凝胶的效力，并使用人鼻上皮细胞和肥大细胞评估其对宿主防御的影响。ROS凝胶显著降低了金黄色葡萄球菌生物膜活力，同时上调了参与先天性和适应性宿主防御的基因。持续释放的H₂O₂增强了抗菌肽、Toll样受体4（TLR4）以及与Th17（RORC）和Th2（GATA3）免疫反应相关转录因子的表达。此外，ROS凝胶调节了基质金属蛋白酶7（MMP7）和基质金属蛋白酶9（MMP9）以及白细胞介素10（IL10）的表达，提示其在组织重塑和炎症消退中发挥作用。这些发现表明，ROS凝胶通过直接抑制细菌生长并调节宿主转录免疫相关基因反应，发挥双重治疗作用。利用以ROS为基础的疗法可能减少对常规抗生素的依赖，并有助于限制抗菌药物耐药性（AMR）的进展。

研究背景方面，抗菌药物耐药性（AMR，指病原体对常规抗菌药物敏感性下降）是全球公共卫生的重大威胁，显著增加发病率和死亡率并推高医疗成本。金黄色葡萄球菌是医院获得性和社区获得性感染的重要病原体，约20–30%的健康人群持续定植，该菌可作为侵袭性疾病储库，常导致菌血症，并与高死亡率及肺炎、心内膜炎、脓毒性关节炎和骨髓炎等多种感染相关。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）等多重耐药菌株的出现和全球传播显著降低了常规抗生素的有效性，迫切需要替代或辅助治疗策略。活性氧（ROS，一类含氧高反应性分子）包括过氧化氢（H₂O₂）、超氧阴离子和羟自由基，在生物系统中具有双重作用：高浓度时通过氧化损伤细菌DNA、蛋白质和脂质发挥强抗菌作用并导致细胞死亡；低浓度且受控时则作为信号分子参与宿主防御、上皮屏障调节和组织修复。ROS凝胶是一种生物工程化碳水化合物和酶基水凝胶，在水合后持续产生低浓度H₂O₂；已有报道显示其对包括MRSA在内的革兰阳性和革兰阴性病原体具有广谱抗菌活性，并在多种临床情境中促进伤口愈合，但其生物学效应的机制基础仍不完全清楚，尤其对宿主免疫和炎症反应的影响尚未系统研究。该知识缺口重要，因为ROS不仅是抗菌剂，也是先天性和适应性免疫的关键调节因子；鼻黏膜是吸入病原体的第一道防线，含有上皮细胞和肥大细胞等特化免疫微环境，其屏障失调与慢性炎症性疾病包括慢性鼻窦炎相关，而慢性鼻窦炎常与金黄色葡萄球菌持续定植相关。因此，研究人员在本研究中采用人鼻上皮细胞和肥大细胞体外研究ROS凝胶的免疫调节效应，并假设ROS凝胶持续低水平释放H₂O₂可在黏膜屏障调节宿主免疫反应，从而调节先天防御机制；该工作聚焦宿主–病原界面生物学而非仅抗菌活性，旨在阐明ROS凝胶是否发挥具有生物学相关性的免疫调节效应，以解释其已报道的临床益处。

研究人员开展了ROS凝胶对多重耐药临床金黄色葡萄球菌分离株及人鼻上皮细胞和肥大细胞的抗菌与免疫调节研究。结论显示，ROS凝胶既显著降低MRSA生物膜活力，又上调先天和适应性宿主防御相关基因，并可由外源H₂O₂重现部分免疫调节效应；这些发现表明ROS凝胶通过直接抑制细菌生长和调节宿主转录免疫相关基因反应发挥双重治疗作用，利用ROS为基础的治疗可能减少对常规抗生素的依赖并有助于限制AMR进展。

为开展本研究，研究人员采用人鼻上皮细胞系RPMI 2650和肥大细胞系HMC-1（均来自ATCC），并以临床样本来源的MRSA分离株CRS-MRSA1建立体外生物膜。关键方法包括：细胞死亡检测评估ROS凝胶及Acacia对照的细胞耐受性；建立48 h成熟MRSA生物膜并以ROS凝胶处理24 h后，通过斑点铺板和菌落形成单位（CFU，菌落形成单位）计数评估生物膜活力；荧光法测定H₂O₂产生；提取RNA、逆转录并进行定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR，定量实时聚合酶链反应）检测免疫相关基因表达；采用GraphPad Prism进行统计分析。

研究结果如下。3.1 Cell Tolerance of ROS Gel（细胞对ROS凝胶的耐受性）：通过细胞死亡检测发现，在具有抗MRSA活性的浓度下，ROS凝胶处理至多2 h诱导的细胞死亡很少，Acacia对照的细胞活力与之一致。3.2 Immunomodulatory Effects of ROS Gel on Epithelial Cells（ROS凝胶对上皮细胞的免疫调节作用）：通过qRT-PCR检测T细胞分化主要转录因子，ROS凝胶改变其表达谱，呈向Th2（辅助性T细胞2）和Th17（辅助性T细胞17）相关转录反应转变；100 g/L处理120 min后RORC在鼻上皮细胞增加1.78倍（p≤0.05）、在肥大细胞增加2.30倍（p≤0.01），TBX21不变，FOXP3呈剂量和时间依赖性下降，GATA3仅在鼻上皮细胞显著增加4.54倍（p≤0.05）；IL22增加11.61倍（p≤0.01），IL23R增加10.10倍（p≤0.0001），IL4增加2.14倍（p≤0.05）；Acacia未影响所检基因。3.3 Effect of the ROS Gel on Host Defence Responses（ROS凝胶对宿主防御反应的影响）：通过qRT-PCR发现，ROS凝胶显著增加鼻上皮细胞TLR4和TNFα表达，并在100 g/L处理120 min后剂量和时间依赖性增加MMP7（31.80倍，p≤0.0001）和MMP9（3.29倍，p≤0.0001）。3.4 Hydrogen Peroxide Production by ROS Gel（ROS凝胶的过氧化氢产生）：通过荧光法测定，ROS凝胶在所有测试浓度产生的H₂O₂显著高于Acacia，并在24 h内逐渐增加，显示持续释放；100 g/L处理2 h时H₂O₂浓度高于1 h；因蜂蜜基配方高葡萄糖诱导渗透应激，细胞培养超过2 h不可行。3.5 Effects of Exogenous Hydrogen Peroxide Treatment（外源过氧化氢处理的影响）：用200–400 μM外源H₂O₂处理60或120 min，产生与ROS凝胶类似的基因表达变化；400 μM处理120 min后GATA3增加2.08倍（p≤0.05）、RORC增加1.33倍（p≤0.05）、IL22增加3.68倍（p≤0.05）、IL23R增加2.71倍（p≤0.01）、MMP7增加5.94倍（p≤0.05），MMP9呈剂量依赖性增加。3.6 ROS Gel and Exogenous Hydrogen Peroxide Promote Anti-Inflammatory and Tissue Remodelling Responses（ROS凝胶和外源H₂O₂促进抗炎和组织重塑反应）：通过qRT-PCR发现，ROS凝胶时间依赖性增加IL10（100 g/L处理120 min增加2.89倍，p≤0.05），400 μM外源H₂O₂处理120 min增加IL10 4.64倍（p≤0.05）；两者均降低IL6，ROS凝胶使IL26增加36.08倍（p≤0.05）；结合GATA3和IL4增加，结果与鼻上皮细胞向Th2相关转录反应转变一致。3.7 Antimicrobial Activity of ROS Gel（ROS凝胶的抗菌活性）：通过已建立生物膜处理24 h发现，ROS凝胶在50–100 g/L显示抗菌活性；100 g/L使MRSA生物膜活力从5.0×10⁷ CFU/cm²降至4.0×10⁶ CFU/cm²（p≤0.05），但总生物膜生物量从OD₆₀₀（600 nm光密度）0.17增至0.31（p≤0.05）。

讨论部分指出，100 g/L ROS凝胶可持续释放约400 μM H₂O₂至少24 h；H₂O₂主要通过氧化损伤细菌蛋白、酶、DNA和膜脂发挥抗菌作用，并可在过渡金属存在下通过Fenton反应转化为更具抗菌活性的羟自由基。鼻黏膜既是金黄色葡萄球菌定植的主要储库，也是第一道免疫屏障，因此研究鼻上皮细胞和紧邻屏障下方的肥大细胞具有相关性。低浓度H₂O₂足以直接抗菌，同时诱导RORC、IL22、IL23R、IL26和TNFA等Th17相关转录特征，并增强TLR4先天免疫信号；GATA3增加提示其还影响Th2相关及上皮稳态通路。MMP7和MMP9升高与组织重塑和免疫细胞募集相关，IL10升高和IL6降低提示在增强抗菌防御的同时限制过度炎症。外源H₂O₂可重现多数免疫调节效应，支持持续H₂O₂释放是主要机制。生物膜总生物量增加而CFU下降，可能与氧化应激下存活菌增强胞外聚合物（EPS，胞外聚合物）产生及细菌裂解释放胞外DNA（eDNA，胞外DNA）有关，反映两种检测参数不同而非抗菌效果矛盾。

研究结论翻译：综上所述，这些发现揭示了ROS凝胶对人鼻上皮细胞和肥大细胞一种此前未被认识到的免疫调节作用。ROS凝胶增强与Th2和Th17相关转录反应有关的介质，同时增加抗菌肽表达和先天免疫激活。这些效应可能至少部分由ROS凝胶产生的H₂O₂介导。既往研究显示其在皮肤中具有抗炎和伤口愈合特性，提示组织依赖性免疫调节。由于有效治疗需要在促炎和抗炎信号之间取得平衡，未来研究应确定最佳ROS凝胶浓度，以最大化病原体清除并限制免疫病理。尽管生物学变异性是一项限制，这些发现拓展了对以ROS为基础疗法的免疫调节和抗菌潜力的理解。下一代合成ROS凝胶配方可能通过克服早期产品相关的变异性和污染，提高一致性、可重复性和纯度，从而促进未来临床转化和更广泛的实践治疗应用。