谷胱甘肽三硫化物通过恢复细胞内超硫化物水平保护人表皮角质形成细胞免受UVB诱导损伤

《Molecules》：Glutathione Trisulfide Protects Human Epidermal Keratinocytes from UVB-Induced Damage via Restoration of Intracellular Supersulfide Levels

　　

紫外线B（UVB）照射可诱导角质形成细胞发生氧化应激和炎症反应，导致皮肤损伤和光老化。尽管超硫化物（supersulfides）近年来已被证实是细胞氧化还原稳态的重要调节因子，但其在UVB诱导的皮肤损伤中的作用仍知之甚少。本研究探讨了代表性超硫化物——谷胱甘肽三硫化物（glutathione trisulfide，GSSSG）在UVB暴露的正常人表皮角质形成细胞（normal human epidermal keratinocytes，NHEKs）中的作用。UVB照射显著降低了细胞活力（cell viability）和细胞内超硫化物水平，同时增加了活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生以及IL-1α、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）和p21的表达。GSSSG预处理显著恢复了细胞内超硫化物水平，改善了细胞活力，抑制了ROS积累和炎症介质产生，并减弱了p21的诱导。此外，GSSSG显著促进了核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，NRF2）的核转位并增加了血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）的产生，表明抗氧化防御通路被激活。敲低半胱氨酰-tRNA合成酶2（cysteinyl-tRNA synthetase 2，CARS2）——一种参与内源性超硫化物生物合成的关键酶——增加了细胞对UVB诱导细胞毒性的敏感性，而GSSSG则恢复了CARS2缺陷细胞的活力。综上所述，这些发现表明GSSSG可保护角质形成细胞免受UVB诱导的氧化应激、炎症和细胞毒性损伤。这种保护活性可能至少部分通过恢复细胞内超硫化物水平和激活NRF2介导的抗氧化反应来实现。

论文解读文章

一、研究背景与目的

紫外线B（UVB）辐射是造成表皮损伤的主要原因之一。UVB容易被角质形成细胞吸收，通过过量产生活性氧（reactive oxygen species，ROS）诱导氧化应激。ROS增加会引起DNA光损伤、脂质过氧化和蛋白质氧化，进而激活细胞内应激通路，促进IL-1α、IL-6和TNF-α等促炎细胞因子的释放。这些氧化和炎症反应加速细胞衰老，损害表皮功能，最终导致光老化、皮肤屏障完整性破坏以及UVB诱导的细胞死亡。

近年来，硫生物学领域的进展揭示，含多个硫原子的反应性硫物种——统称为超硫化物（supersulfides）——可通过半胱氨酰-tRNA合成酶2（cysteinyl-tRNA synthetase 2，CARS2）等生物合成酶在人体内源性产生。超硫化物参与多种生物学过程，包括氧化应激调控、炎症反应调节以及线粒体能量代谢维持。然而，UVB照射对人表皮角质形成细胞内超硫化物水平的影响此前尚不清楚。

谷胱甘肽三硫化物（glutathione trisulfide，GSSSG）是超硫化物家族的代表性成员，具有强效抗氧化和抗炎特性。GSSSG可增强细胞能量代谢并在多种应激条件下发挥细胞保护作用，还能增加细胞内反应性硫物种水平。然而，GSSSG对UVB诱导皮肤损伤的细胞保护作用此前基本未被探索。基于此，研究人员开展了本研究，旨在探讨GSSSG对UVB暴露的正常人表皮角质形成细胞（normal human epidermal keratinocytes，NHEKs）的保护作用及其机制，并考察NRF2信号通路和CARS2在其中的参与情况。

二、主要技术方法

研究人员使用来自日本Kurabo公司单一人供体的NHEKs（编号KK-4009）进行体外实验。UVB照射采用UVP Crosslinker CL-3000M设备（峰值波长302 nm），经预实验确定20 mJ/cm2为后续实验剂量。细胞活力通过MTT法检测；细胞内超硫化物水平使用Sulfane Sulfur Probe 4（SSP4）荧光探针测定；ROS水平采用DCFH-DA荧光探针检测；IL-1α、PGE₂和HO-1蛋白水平通过ELISA试剂盒定量；p21 mRNA表达通过RT-qPCR检测；NRF2核转位通过免疫荧光染色和荧光显微镜成像定量。CARS2基因敲低采用siRNA转染技术实现。

三、研究结果

3.1 GSSSG保护NHEK细胞免受UVB损伤

研究人员首先通过MTT实验评估细胞活力，发现UVB照射显著降低NHEKs细胞活力，而GSSSG预处理以浓度依赖方式减轻了UVB诱导的细胞活力下降。形态学观察显示，UVB照射导致细胞 detachment 增加和细胞碎片积累，而GSSSG预处理显著抑制了这些形态学改变。SSP4荧光探针检测显示，UVB照射显著降低了细胞内超硫化物水平，而GSSSG预处理显著逆转了这一降低。值得注意的是，在无UVB照射条件下，GSSSG单独处理显著增加了细胞内超硫化物水平，但对细胞活力无显著影响。

3.2 GSSSG对抗UVB诱导的氧化应激和炎症

DCFH-DA探针检测结果显示，UVB照射显著增加细胞内ROS水平，而GSSSG预处理显著抑制了UVB诱导的ROS升高。ELISA检测结果显示，UVB照射显著增加了炎症介质IL-1α和PGE₂的水平，而GSSSG预处理显著减弱了UVB诱导的这两种炎症介质水平的升高。

3.3 GSSSG对NRF2介导抗氧化信号通路的影响

免疫荧光染色结果显示，与单独UVB组相比，GSSSG联合UVB处理组的NRF2核转位显著增加。ELISA检测显示，GSSSG处理显著增加了NRF2下游靶基因HO-1的表达。这些结果表明GSSSG处理与UVB暴露NHEKs中NRF2信号通路的激活相关，该反应可能有助于GSSSG的细胞保护作用。

3.4 GSSSG减弱NHEKs中UVB诱导的细胞衰老标志物

RT-qPCR检测结果显示，UVB照射显著增加了p21的mRNA表达，而GSSSG处理显著减弱了UVB诱导的p21表达升高。由于p21是细胞周期阻滞和细胞衰老的关键调节因子，这些发现表明GSSSG可能减轻UVB照射诱导的NHEKs衰老相关反应。

3.5 CARS2敲低对UVB敏感性和GSSSG保护活性的影响

研究人员通过siRNA沉默CARS2建立超硫化物缺陷细胞模型。结果显示，CARS2敲低显著增加了NHEKs对UVB照射的敏感性，细胞活力较对照组显著降低。GSSSG处理显著恢复了CARS2缺陷细胞的活力，并显著恢复了其细胞内超硫化物水平。此外，siCARS2组的NRF2核转位较siControl组显著减少，而GSSSG处理显著增加了CARS2敲低细胞中的NRF2核转位。

四、讨论总结与研究结论

研究讨论部分指出，氧化应激是UVB诱导皮肤损伤的主要机制之一。GSSSG的抗氧化作用可能通过多种互补机制实现，包括激活NRF2/HO-1通路、直接抗氧化活性以及恢复细胞内超硫化物稳态。在炎症方面，GSSSG的抗炎作用可能与其减弱氧化应激的能力密切相关，ROS的减少可能抑制了炎症信号通路的上游触发。此外，超硫化物本身也被报道可调节多种生物系统中的炎症反应。

关于超硫化物在UVB应答中的作用，研究人员证明UVB暴露显著降低了NHEKs中的细胞内超硫化物水平，这可能反映了超硫化物作为细胞防御反应的一部分被消耗。CARS2敲低实验证实内源性超硫化物有助于细胞抵抗UVB诱导的损伤，而外源性GSSSG补充可以部分补偿内源性超硫化物产生受损。

从应用角度看，GSSSG减弱UVB诱导的氧化应激、炎症和细胞毒性的能力表明其作为预防性护肤成分具有潜在应用价值。维持细胞内超硫化物稳态可能支持表皮防御机制并帮助维持皮肤稳态。

研究结论：本研究证明GSSSG通过抗氧化和抗炎机制减轻UVB诱导的人表皮角质形成细胞损伤，并伴随细胞内超硫化物水平的恢复。研究结果强调了细胞内超硫化物稳态在表皮对UVB诱导损伤的防御反应中的关键作用，并提示GSSSG作为预防光老化和维持皮肤健康的生物活性成分具有应用潜力。