《Molecules》：Polymer Physics Predicts Conformational Diversity of Individual Chromatin Molecules
单细胞与超分辨成像的近期进展揭示，染色质在单个细胞中呈现高度异质且动态的三维构象。然而，这种变异性的程度、其潜在机制以及功能后果仍难以通过实验定量。本文综述了结合聚合物物理学、分子动力学模拟与数据驱动方法在单分子水平上重建和预测三维染色质构象系综的最新进展。我们讨论了聚合物相分离（phase separation，PS）模型与环挤压（loop extrusion，LE）模型如何同时重现群体平均接触数据与独立的单细胞成像测量结果。这些方法有助于区分构象多样性的不同来源，包括聚合物折叠固有的热力学简并性以及细胞间异质性。我们进一步讨论了关键结构因子（特别是黏连蛋白cohesin）的扰动如何影响染色质构象和单细胞结构变异性。总体而言，聚合物物理学模型提供了一个定量框架，用于将染色质折叠的分子机制与实验观察到的单分子异质性构象系综相联系。
1. 引言
染色质的三维（3D）组织在控制基因组功能（如基因调控）中发挥核心作用。在哺乳动物细胞核内，染色体折叠成复杂的分层结构，涵盖多个基因组尺度，从局部环、拓扑关联结构域（TAD）到A/B区室和兆碱基级的染色体领地。基于群体的方法（包括染色体构象捕获、Hi-C以及无连接方法如GAM和SPRITE）通过提供染色质接触的全基因组图谱，对揭示这些折叠原理至关重要。然而，由于这些测量通常在大量细胞群体上取平均，它们不能直接捕获单条染色质分子所采用的构象。
与此互补，单细胞和超分辨多重荧光原位杂交（FISH）成像的进展使得直接在单个细胞核中检查染色质构象成为可能，揭示了细胞间广泛的结构异质性和动态。实验表明，TAD样结构域和球状结构可以在单分子水平检测到，但其基因组位置、形状和相互作用模式因细胞而异。因此，群体平均接触图中观察到的结构域并不对应于所有细胞共有的唯一染色体结构，而是源于异质性单分子构象的系综。这种结构变异性可能具有功能后果，因为染色质折叠差异可调节基因与调控元件之间的空间邻近性，从而促成基因调控的细胞间差异。破坏TAD边界的基因组突变与基因错误表达和疾病相关联。因此，理解产生这种构象多样性的物理机制，以及这种结构变异性如何与特异且功能相关的基因组相互作用共存，已成为染色体生物学的核心挑战。
为解决此问题，基于聚合物物理学的多种定量模型已被开发，以识别塑造染色体构象的分子和物理机制。两类模型因分子成分较为明确而受到特别关注。环挤压（LE）模型将染色质折叠描述为主动的非平衡过程，其中 cohesin 等分子复合物沿染色质纤维转位，逐步扩大环，直到挤压被例如会聚方向的 CTCF 位点所阻挡。另一类模型依赖于染色质区域间的偏好性相互作用，通过聚合物相分离（PS）驱动空间分离和紧凑结构域的形成。在这些模型中，聚合物基于实验确定的生物学（如表观遗传）信息被划分为不同的单体或染色质类型，类型特异性相互作用驱动其空间分离。
Strings and Binders（SBS）模型属于相互作用驱动的相分离类。SBS 模型将染色质表示为携带不同类别结合位点的自回避聚合物，这些位点通过同源分子结合蛋白相互作用。与其他方法不同，这些结合位点的基因组排列可直接从实验接触图推断，无需表观遗传注释作为先验信息。尽管表述和分子解释不同，基于相分离的模型共享染色体组织可通过特定染色质状态或结合结构域之间的偏好性相互作用涌现的核心原理。
除上述特定折叠机制外，染色体构象还受细胞核物理环境影响。染色体在受限核体积内密集堆积，限制和拓扑约束促成紧凑领地结构的形成。大分子拥挤可通过熵耗尽效应促进压缩和稳定折叠状态，而与核纤层的相互作用以细胞间可变方式将大染色质结构域锚定于核周缘，异染色质相互作用驱动核的大规模区室化。这些因素可重塑染色质的可及构象景观并调节其细胞间变异性。
在此更广泛的物理背景下，本文审视个体基因组位点的内在折叠机制，在该尺度上最小聚合物物理学模型已捕获单细胞结构的关键特征。我们讨论如何将这些模型定量用于解释和预测单条染色质分子的广泛构象多样性。为此，我们集中于环挤压和 SBS 模型分别作为主动性和基于相分离机制的代表。我们讨论它们产生跨单个构象结构变异性的物理机制，并检验它们如何忠实重现群体平均和单细胞测量。作为示例，我们考虑人 HCT116 细胞中一个 2.5 Mb 位点（chr21:34.6–37.1 Mb, hg38），简称 HCT116 位点，该位点同时具有群体平均 Hi-C 和多重单细胞成像数据。我们表明这些模型不仅捕获平均接触和空间距离图，还捕获单条染色质结构的非平凡特性，包括单细胞中 TAD 样边界分布、空间分离和细胞间构象变异性。随后我们检验关键结构因子（特别是 cohesin 耗竭）的扰动如何改变染色质折叠及其结构异质性，说明聚合物模型如何将折叠的特定分子机制与实验观察到的 3D 构象多样性联系起来。
总体而言，这些研究表明聚合物物理学模型可以超越平均染色体架构的重建，预测单条染色质分子所采用的异质性构象系综。通过将分子机制、3D 结构和细胞间变异性统一在定量框架内，这些方法为预测疾病相关突变、改变调控状态或靶向扰动如何影响染色质组织提供了基础。
2. 染色质折叠的物理机制
2.1. 环挤压模型
环挤压为染色质环和拓扑关联结构域的形成提供了一种物理机制，基于分子复合物沿染色质的主动转位。根据该模型，环挤压复合物结合染色质并沿聚合物移动逐步扩大环，直到挤压被解离、与另一个挤压器碰撞或遇到特定锚位点而中断。在哺乳动物细胞中，cohesin 被鉴定为环挤压机器的主要成分，而具有会聚方向的 CTCF 结合位点可促进特定环的形成并有助于 TAD 边界定位。由于转位需要能量供应，环挤压本质上是主动的非平衡折叠机制。聚合物的环挤压实现通过引入动态键或弹簧来模拟这一过程，这些键或弹簧在挤压过程中连接链上越来越远的位点。挤出器的随机结合和解离自然产生聚合物构象的系综而非单一确定性结构。在最简单的实现中，锚位点位置和方向固定且在分子间共享。更精细的实现可在单个构象之间引入锚位点占据的可变性，为每个位点分配在每个分子中存在的概率。此类扩展可解释细胞间分子景观差异，并提高基于 LE 的模型在群体和单分子水平重现实验接触和距离模式的能力。因此，尽管模型的物理原理是环的主动挤压，最终染色质结构取决于挤出器的动力学、聚合物涨落以及锚位点的基因组分布和可及性。该模型提供了 cohesin、CTCF 结合位点、转录调控与染色质环和边界涌现之间的直接机制联系，而结构变异性源于挤压过程的随机性和单个细胞的分子异质性。
2.2. 基于相分离的模型
另一类染色质聚合物模型将折叠描述为特定 DNA 区域之间偏好性相互作用的结果，而非依赖主动马达将远距离位点拉近。该类模型沿聚合物编码不同的生化或表观遗传身份，并为相应染色质类型分配不同的相互作用亲和力。相容区域间的吸引相互作用（直接或通过扩散的蛋白质样桥接分子介导）可驱动其偏好性相互作用和空间分离，通过自相互作用聚合物的统计力学产生紧凑结构域和区室化染色体构象。尽管微观实现差异显著，这些方法共享基本原理：染色质结合位点的异质一维序列可通过类型依赖性相互作用转化为非随机的 3D 架构。
已提出若干基于相分离的聚合物模型。例如，嵌段共聚物模型、Chromosome Copolymer Model（CCM）、MiChroM 及相关方法将染色质表示为由不同单体类型组成的异聚物，通常由输入的表观遗传信息定义，其偏好性相互作用驱动平衡态下的结构域形成、微相分离和异质性 3D 构象。这些相互作用可实现为染色质区段间的直接吸引或多价分子桥接远距离同源位点。后者中，桥接可提高结合位点和结合蛋白的局部浓度，通过称为桥接诱导相分离的正反馈机制促进更多相互作用。尽管微观实现不同，这些模型属于同一广义物理类（自相互作用异聚物），因此可表现出类似的线团-球状转变和相互作用域的空间分离。
Strings and Binders（SBS）模型提供了该相互作用驱动情景的一种特别通用且易处理的实现。染色质表示为携带不同类别结合位点的自回避行走（SAW）聚合物，而扩散的同源分子桥接对应类型的位点。其构象折叠状态由聚合物熵与结合蛋白介导吸引之间的竞争决定。在低结合蛋白浓度或亲和力下，熵占主导，聚合物保持开放（“线团”）态。高于特征相互作用阈值后，结合蛋白介导的吸引克服压缩的熵代价，驱动向球状状态转变，不同类别的结合位点组装成空间分离的结构域。SBS 模型的关键特征是结合位点的基因组位置和身份无需预先指定表观遗传注释，可直接通过数值优化方法从实验接触图推断。推断的结合域随后可与染色质相关因子和表观遗传特征相关联，提供其组合作用模式的可检验分子预测。
3. 群体平均水平的聚合物折叠
LE 和基于 PS 的模型均已被证明能够重现群体平均染色质结构的关键特征，包括环和 TAD 样结构域，尽管依赖的物理机制差异显著。对 2.5 Mb HCT116 位点进行了直接比较。多重 FISH 测量提供了单个细胞中基因座之间的成对空间距离。取每对位点跨细胞的中间距离产生具有明显结构域样模式的群体水平距离矩阵。使用 LE 或 SBS 相互作用构建相同区域的聚合物模型，其中 LE 锚位点和 SBS 结合域的基因组分布限定了位点特异性折叠约束。由两个模型生成的系综用于计算相应的中间距离矩阵。值得注意的是，两种机制都重现了实验观察的主要结构域尺度模式。使用基因组距离校正的 Pearson 相关 r′（去除距离对基因组分离的平凡依赖）进行定量，实验矩阵与 LE 和 SBS 模型预测之间的 r′ 分别为 0.87 和 0.84，显著高于随机折叠聚合物预期近零相关。因此，尽管 LE 通过动态挤出的环组织染色质，SBS 模型依赖结合域间偏好性相互作用，两种机制均定量重现其群体水平空间组织。
这种一致性扩展到 TAD 样边界的基因组分布。边界概率衡量每个基因组位置在单个构象中作为结构域边界出现的频率。两个模型均重现非均匀实验边界谱，LE 和 SBS 的 Pearson 相关分别为 r = 0.50 和 r = 0.79。SBS 模型更强的相关可能反映其推断结合域所编码的更广泛信息。在 LE 模型中，偏好边界位置源于 CTCF/cohesin 定义的锚位点，而 SBS 结构域有效代表群体平均接触矩阵捕获的更广泛相互作用决定因素。值得注意的是，在同一 HCT116 位点，显微镜数据表明 TAD 样边界遍布整个区域，仅在部分 CTCF/cohesin 位点优先富集。此外，cohesin 耗竭消除了偏好边界定位和群体平均 TAD，但未消除单细胞中的 TAD 样结构域，暗示 CTCF/cohesin 以外的因素参与其形成。与 CTCF/cohesin 非依赖折叠相关的转录、BRD4、RNA 聚合酶 II 和凝聚体介导相互作用已有广泛报道。SBS 推断结构域与 CTCF/cohesin、转录调控因子以及活性或抑制性染色质标记的不同组合相关，使模型能够整合多种染色质相关因子的有效贡献，从而可能解释其与实验边界谱更强的一致性。
总之，这些结果表明 LE 和 SBS 模型均可定量解释染色质的平均折叠，尽管底层分子机制不同。下一个关键检验是它们是否也能重现这些群体水平模式背后的单分子构象的分布和结构异质性，这需要超越系综汇总，直接比较实验测量和模型预测的单条染色质构象。
4. 单分子水平的构象多样性
群体水平接触和距离图仅提供染色体组织的部分描述，因为相似的平均模式可由不同的单分子构象分布产生。多重 FISH 测量现在可对聚合物模型进行更严格的检验，即其预测系综是否不仅重现平均染色质结构，还重现细胞间观察到的结构多样性。在所考虑的 HCT116 位点中，单分子距离矩阵表现出明显的 TAD 样模式，其位置、大小和内部组织在细胞间差异显著。基于 LE 和 SBS 机制的模拟均生成类似广泛多样性的单分子结构，每个结构代表输入仅为群体平均数据的聚合物模型的独立稳态实现。
这种结构异质性可通过成对相关性（即两个单分子构象距离矩阵之间的 r′ 相关）量化，其在系综内所有分子对上的分布衡量结构相似性。实验分布宽泛，表明不同分子保留一定程度共同组织同时采用显著不同构象。SBS 分布与实验参考密切匹配，平均 r′ = 0.22，非常接近实验值 0.24。重要的是，成对相关不用于推断模型，也没有参数拟合它们：它们是从单分子构象系综的事后计算，因此与实验数据的一致性提供了模型在单分子水平的独立验证。相反，LE 分布向较低相关移动（平均 r′ = 0.11），表明 LE 构象平均彼此相似性较低，因此表现出更高程度的结构变异性。这种差异可能反映 LE 聚合物本质上仍是受 CTCF/cohesin 介导环局部约束的开放线团状自回避链，由于环的随机形成和溶解，聚合物可探索更广泛的空间排列；而 SBS 模型中结合域间偏好性相互作用驱动更紧凑且结构持久的球状构象。因此，尽管两种机制重现群体水平折叠，单分子比较更清晰地区分其生成的构象系综。
单细胞异质性还扩展到染色质的整体几何。在简单几何水平，单个染色质构象可近似为三轴椭球并测量其主轴比值。实验 HCT116 结构表现出 a/b 和 b/c 轴比的宽分布，而非单一刻板形状。LE 和 SBS 模型均重现这些分布的主要特征，表明它们捕获了实验观察到的单分子各向异性和形状变异性。在所有三个系综中，a/b 比值大于 b/c 比值占主导，与优先长球形（而非球形）构象一致。
在染色质压缩方面也观察到类似一致性。根据相对体积对单分子分类揭示从更紧凑到更开放的异质性群体。两个模型均重现实验各压缩类别的比例，表明其构象系综覆盖的体积范围与多重 FISH 测量相当。成对相关、形状和压缩分析共同证明聚合物模型可解释基因组构象多样性的多个独立方面，超越位点的群体水平结构，为理解复杂生物学功能（如单分子基因调控）提供机制基础。
这种结构多样性是聚合物折叠统计性质的固有结果，不一定需要每个分子采用不同相互作用规则。在 SBS 模型中，热涨落和结构域分离态的热力学简并允许多个具有相当自由能的结构域排列在同一系综中共存。在 LE 模型中，随机挤出器结合、转位和解离在不同分子间产生不同环构型。细胞间分子约束差异（如锚位点占据或结合蛋白可用性）可进一步拓宽这些分布。因此，染色质异质性可源于聚合物动力学的内在随机性和影响染色体折叠的分子因子的变异。
5. cohesin 耗竭增强单分子构象变异性
扰动染色质结构因子为识别控制染色体折叠及其细胞间变异性的分子机制提供了直接手段。Cohesin 耗竭已被证明深刻改变群体水平结构域组织。在携带生长素诱导 cohesin 降解系统的 HCT116 细胞中，未处理细胞中明显的结构域模式基本消失，群体水平距离矩阵主要由基因组距离依赖性对角线信号主导。LE 和 SBS 模型均重现这种更均匀的平均组织，与 cohesin 通过环挤出和潜在桥接介导相互作用参与染色质折叠一致。
Cohesin 耗竭的后果在单分子水平更有趣。尽管群体水平矩阵失去结构域，单个 HCT116 + Auxin 构象保持异质性且可显示非平凡接触模式。其对应 r′ 相关分布宽且中心近零，表明不同分子间结构相似性低，比未处理细胞具有更大构象变异性。LE 和 SBS 模型均重现这种向宽近零成对相关分布的移动。因此，可重复平均结构域模式的丧失可与单分子中实质结构和异质性共存。
在 LE 框架内，cohesin 耗竭移除了产生染色质环的马达，使聚合物转向由随机接触主导的自回避行走状态。在 SBS 模型中，它削弱稳定紧凑结构域的结合蛋白介导相互作用——鉴于 cohesin 也可桥接远距离 DNA 片段并促进 DNA-cohesin 凝聚，这是一种合理解释。在两种情况中，瞬时局部结构可能以可变基因组位置持续存在，但在系综平均时消失，产生基本无特征的群体水平图。
Cohesin 耗竭后，异质性单细胞结构域仍可检测，但其边界失去偏好基因组定位。虽然不能排除不完全耗竭，但这种持续也与 cohesin 非依赖相互作用一致：可变单细胞结构域发生在活性及非活性 X 染色体上，且在大表观遗传组分和转录扰动后基本保留，暗示多种分子因子的组合贡献。
共同地，扰动实验和聚合物建模支持这样的图景：cohesin 在染色体组织中起主要但非排他作用。Cohesin 有助于建立产生群体水平 TAD 模式和限制构象变异性的折叠约束，而随机聚合物折叠和额外染色质相互作用可维持其耗竭后的异质性结构域样结构。因此，单细胞染色质组织可能源于多种折叠机制的联合作用，而非仅 cohesin 活性。
6. 结论
本综述证明基于环挤压和基于相分离的机制均可在群体和单分子水平重现染色质组织的关键特征。尽管物理原理不同，两者生成的构象系综与批量接触图和显微镜数据一致，同时捕获单个染色质结构的非平凡特性。但其变异性来源不同：基于相分离模型采样多个热力学可及的聚合物状态，而环挤压模型通过随机挤出器动力学和锚位点占据的分子间变异产生异质性。
这些机制不必相互排斥。环挤压和聚合物相分离可同时作用于同一染色质分子，组合它们的模型可改善对多个实验观测量的描述，包括高阶接触。染色体折叠因此正从主动和热力学过程相互作用中涌现，而非来自单一主导机制。
扰动实验表明 cohesin 耗竭破坏群体水平结构域组织并增加单分子构象变异性，但异质性结构域样结构在单个染色体中持续存在。结合推断相互作用域与结构蛋白和表观遗传特征组合的关联，这种持续性提示 cohesin 具有主要但非排他作用，多种分子因子共同塑造可及构象系综。
除本文详述的 LE 和 SBS 模型外，越来越多的聚合物物理方法与单细胞成像数据整合，涵盖多重 FISH、染色质示踪和 ORCA。这些包括描述果蝇单细胞 TAD 作为纳米隔室的聚合物模型、显示染色体动力学接近溶胶-凝胶转变控制远距离基因组遭遇时机的交联染色质模型、考虑 FISH 揭示的细胞间构象异质性的广义 Rouse 模型、直接从成像成对距离重建 3D 结构系综的最大熵方法，以及经成像测量验证的二倍体基因组组织数据驱动模型。这些研究将 LE 和 SBS 模型置于单细胞染色质组织聚合物模型更广泛背景中，均指向结构异质性作为染色体折叠的定义特征。
未来扩展可明确纳入这些额外物理因素，评估它们如何调节单分子结构异质性的程度和性质。总体而言，这突出表明染色质构象多样性不只是平均结构周围的实验噪声，而是染色体组织的固有属性。由于不同机制可产生相似群体水平模式，单细胞测量对区分替代物理模型至关重要。反过来，聚合物模型提供解释这些异质结构并将其与底层分子相互作用联系的机制框架。整合群体水平和单细胞数据因此可将聚合物建模超越平均染色质架构重建，走向预测遗传变异、表观遗传改变和靶向扰动如何重塑染色质的完整构象景观及其调控功能。
7. 方法
7.1. 实验数据和研究位点
本综述讨论的模型指人 HCT116 细胞中 2.5 Mb 位点 chr21:34.6–37.1 Mb（hg38），其多重 FISH 数据提供单个细胞中连续 30 kb 基因组片段的 3D 坐标。为在单分子水平检验模型，仅使用群体平均信息（即批量 Hi-C 数据）作为输入，单细胞成像数据仅用于独立验证。
7.2. 聚合物模型
在 LE 和 SBS 模型中，染色质区域表示为直径 σ 的珠子自回避链，连续珠子通过有限延伸非线性弹性弹簧连接，珠子重叠由短程排斥势防止。LE 模型中，环挤出因子建模为额外的谐波弹簧，结合聚合物链并沿其转位挤出环。其数目固定、不能相互穿过，转位在遇到另一挤出器或相反方向锚位点时停止，除非随机解离。锚位点位置和方向通过基于 CTCF ChIP-seq 峰的标准基序查找分析确定。为解释细胞间表观遗传异质性，每个锚位点以有限概率存在于给定单分子中。SBS 模型中，聚合物链携带不同类别特异性结合位点及较低亲和力的非特异性位点。结合亲和力处于弱生化能量范围。结合蛋白是扩散布朗粒子，仅与同类型结合位点相互作用并可桥接它们，通过相变热力学机制驱动链折叠。结合位点基因组位置和类型由 PRISMR（基于聚合物物理的机器学习程序）从批量 Hi-C 数据推断，无需先验表观遗传信息。模型 3D 构象通过 LAMMPS 分子动力学模拟生成，从独立自回避行走构象开始运行至稳态。每个模型收集 103 个独立平衡单分子结构系综。模型使用群体平均实验数据参数化，未拟合单细胞构象，因此所得单分子构象系综是真实模型预测。模拟距离以珠子直径 σ 为单位，通过匹配模型与实验回转半径分布中位数转换为物理单位。此校准仅设置长度尺度，未在单细胞数据上拟合参数。
7.3. 构象系综的定量比较
所有模型-实验比较均以 30 kb 分辨率进行。两个距离矩阵之间的相似性通过基因组距离校正的 Pearson 相关 r′ 量化，即从每个条目减去其所属对角线平均值后计算的 Pearson 相关。在中间距离矩阵之间计算时，r′ 衡量群体水平相似性；在两个单分子构象距离矩阵之间计算时，定义为成对相关，其在系综内所有构象对上的分布量化单分子结构异质性。r′ 分布之间的统计差异使用双侧 Mann–Whitney U 检验评估。
