《Molecules》：Streptomyces antiinflammaticus from Rehmannia glutinosa Produces Dual Immunomodulatory Metabolites That Upregulate IL-10 and Inhibit GSK3β/NF-κB
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中文摘要翻译：
从药用植物地黄（Rehmannia glutinosa）根际分离得到菌株RerS4，并对其分类学地位及抗炎次级代谢产物进行了系统研究。多相分类学结合基于基因组学的分析，包括平均核苷酸一致性（average nucleotide identity
中文摘要翻译：
从药用植物地黄（Rehmannia glutinosa）根际分离得到菌株RerS4，并对其分类学地位及抗炎次级代谢产物进行了系统研究。多相分类学结合基于基因组学的分析，包括平均核苷酸一致性（average nucleotide identity，ANI，82.87–85.87%）和数字DNA-DNA杂交（digital DNA-DNA hybridization，dDDH，26.7–31.9%），确认RerS4代表一个链霉菌（Streptomyces）新种，命名为Streptomyces antiinflammaticus。研究人员利用A549和THP-1细胞中的IL-6/TNF-α抑制生物测定法筛选了八种发酵培养基，并选用具有最佳抗炎活性的GYM I培养基进行大规模发酵。从发酵液中纯化出五种次级代谢产物，包括一个未报道的酰胺类化合物（1）及四个已知化合物（2–5）。生物活性测定表明，化合物1和5可抑制促炎细胞因子的产生。机制研究表明，两种化合物均能抑制A549细胞中p65（Ser536）和GSK3β（Tyr216）的磷酸化。在THP-1巨噬细胞中，化合物1选择性靶向p65，而化合物5对两种蛋白均有抑制作用。qPCR结果显示，化合物1下调促炎细胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）并上调抗炎细胞因子IL-10，而化合物5在A549细胞中降低IFN-γ mRNA表达。该研究表明，Streptomyces antiinflammaticus是发现独特抗炎及免疫调节天然产物的宝贵资源。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
炎症是类风湿关节炎、动脉粥样硬化、衰老相关病变、代谢紊乱、癌症及神经退行性疾病等多种人类疾病的共同病理基础。目前临床常用的抗炎策略主要依赖非甾体抗炎药（NSAIDs）和糖皮质激素，但这些药物常伴随心脏毒性、肝毒性及过度免疫抑制等不良反应。因此，亟需开发靶向明确细胞内靶点、具有更宽治疗窗口的新型先导化合物。微生物天然产物因其结构和生物合成途径的多样性，一直是药物先导化合物的重要来源。
放线菌，尤其是与药用植物根际相关的链霉菌属（Streptomyces）菌株，是公认的具有抗炎活性的生物活性次级代谢产物高产菌。已有研究表明，来源于地衣的Streptomyces gramineus产生的actinofuranones D–I具有显著抗炎活性；来源于红树林的Streptomyces xiamenensis产生的xiamenmycin A可同时抑制炎症反应和机械应力，在增生性瘢痕和纤维化疾病中展现出治疗潜力。值得注意的是，少量微生物代谢物已被证实不仅能抑制促炎细胞因子，还能上调抗炎细胞因子IL-10，从而发挥双向免疫调节作用。这种双重调控被认为比传统单靶点药物更具治疗优势，然而，连接根际链霉菌代谢物与GSK3β及下游NF-κB信号通路的分子机制仍不清楚。
地黄（Rehmannia glutinosa）是一种广泛使用的具有抗炎功效的药用植物，但其根际可培养链霉菌及其产生的信号介质和分子靶点此前鲜有研究。本研究旨在解决这一科学空白，对从地黄根际分离的菌株RerS4进行分类学鉴定、化学产物解析及免疫调节机制研究。
二、研究内容与主要结论
研究人员对菌株RerS4进行了全面的多相分类学鉴定，结合表型特征和基因组学分析，确认其为链霉菌属新种，命名为Streptomyces antiinflammaticus。通过筛选八种发酵培养基，确定GYM I培养基为最优抗炎活性产物生产条件，并从中分离纯化出五种次级代谢产物，包括一个新化合物（Z）-N-（4-羟基苯基）二十一碳-11-烯酰胺（化合物1）和已知化合物阿魏酸（化合物5）。生物活性研究表明，化合物1和5均能显著抑制促炎细胞因子分泌，且化合物1具有独特的IL-10上调能力，实现双向免疫调节。机制研究揭示，两种化合物通过抑制p65（Ser536）和GSK3β（Tyr216）磷酸化调控NF-κB信号通路，但作用模式存在细胞类型依赖性差异。该研究首次提供了地黄根际链霉菌代谢物作用于NF-κB信号轴的实验证据，支持进一步开发药用植物根际链霉菌作为抗炎先导化合物的来源。
三、关键技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：多相分类学鉴定（结合形态学、生理生化特征和16S rRNA系统发育分析）；基因组学分类分析（包括平均核苷酸一致性ANI和数字DNA-DNA杂交dDDH分析）；发酵培养基系统筛选（利用A549和THP-1细胞模型中的IL-6/TNF-α抑制生物测定）；次级代谢产物分离纯化（采用中压液相色谱MPLC、硅胶柱色谱、Sephadex LH-20凝胶色谱和制备型高效液相色谱prep-HPLC等技术）；结构鉴定（采用高分辨质谱HR-ESI-MS和核磁共振NMR波谱分析）；抗炎活性评价（ELISA检测细胞因子分泌水平）；基因表达分析（qRT-PCR）；信号通路蛋白检测（Western blotting）。菌株RerS4分离自环腐病感染地黄根际土壤，保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC NO. M 20251535）。
四、研究结果
4.1 菌株RerS4的分类学特征
菌株RerS4为革兰氏阳性、好氧、非运动性放线菌。在ISP 2、ISP 3、Bennett's和Cha's琼脂培养基上生长旺盛。其16S rRNA基因全长序列（1523 bp）与Streptomyces racemochromogenes NRRL B-5430T和Streptomyces polychromogenes NBRC 13072T具有最高相似性（99.72%）。全基因组系统发育分析表明RerS4与S. lavendulae亚种等菌株聚于同一大分支。ANI值（82.87–85.87%）和dDDH值（26.7–31.9%）均低于物种界定标准阈值（ANI 95–96%，dDDH 70%），结合明显的表型差异，确认菌株RerS4代表链霉菌属新种，命名为Streptomyces antiinflammaticus。
4.2 发酵培养基筛选
研究人员利用TNF-α刺激的A549细胞和LPS刺激的THP-1巨噬细胞，系统评价了八种发酵培养基的发酵液抗炎活性。在A549细胞中，GYM I、H9和HZ-2培养基的发酵液表现出最佳抗炎效果；在THP-1巨噬细胞中，除ISP 2外其余七种培养基均有效缓解炎症反应。综合两种细胞模型的抗炎表现，最终选择GYM I培养基用于大规模发酵。
4.3 化合物结构鉴定
从GYM I培养基发酵液中分离纯化出五种次级代谢产物。化合物1为新的酚性脂肪酰胺，经HR-ESI-MS和NMR综合分析确定为（Z）-N-（4-羟基苯基）二十一碳-11-烯酰胺。化合物2鉴定为2,4-喹唑啉二酮，化合物3鉴定为（E）-十四碳-8-烯酸，化合物4鉴定为3-羟基苯甲酸甲酯，化合物5鉴定为3-甲氧基-4-羟基肉桂酸，即阿魏酸。
4.4 化合物1和5的抗炎机制
CCK-8细胞毒性实验证实五种化合物在高达200 μM浓度下对A549和THP-1细胞均无明显细胞毒性。ELISA结果表明化合物1和5均显著抑制TNF-α刺激的A549细胞和LPS刺激的THP-1巨噬细胞中促炎细胞因子TNF-α和IL-6的分泌。qRT-PCR结果显示，化合物1在两种细胞中均下调IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表达并上调IL-10表达；化合物5在两种细胞中均显著降低IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA水平，并在A549细胞中额外降低IFN-γ表达。Western blotting分析表明，化合物1浓度依赖性地抑制A549和THP-1细胞中p65（Ser536）磷酸化，但仅在A549细胞中抑制GSK3β（Tyr216）磷酸化；化合物5在A549细胞中浓度依赖性地抑制p65和GSK3β磷酸化，在THP-1细胞中150 μM浓度下显著降低两种信号蛋白的磷酸化水平。
五、讨论与结论
本研究通过基因组学和表型证据确认菌株RerS4为链霉菌属新种Streptomyces antiinflammaticus，其基因组含有丰富的非核糖体肽合成酶（NRPS）和聚酮合酶（PKS）生物合成基因簇，预示其具有独特的代谢产物产生潜力。从优化后的GYM I培养基中成功分离出五种次级代谢产物，其中化合物1为新化合物，化合物5为已知的阿魏酸。两种化合物均通过抑制NF-κB信号通路发挥抗炎作用，但化合物1在巨噬细胞中的抗炎活性可能不依赖GSK3β，而化合物5在两种细胞中均抑制GSK3β磷酸化，且额外具有降低IFN-γ表达的能力，提示其可能同时调节先天性和适应性免疫应答。化合物1独特的IL-10上调能力赋予其双向免疫调节功能，对慢性炎症性疾病的治疗开发具有重要价值。
研究存在以下局限性：化合物1和5的发酵产量较低，限制了体内药代动力学表征和系统性治疗评价；所有机制结论均来自体外细胞模型，需在动物模型中验证；化合物与p65和GSK3β的直接分子相互作用尚未得到实验证实。未来研究将聚焦于发酵优化以提高代谢物产量、扩展细胞毒性评价、结构修饰进行构效关系分析、直接靶点验证及体内药理学验证。
综上所述，本研究在分类学上确认菌株RerS4为地黄根际来源的链霉菌新种Streptomyces antiinflammaticus，功能表征证实该菌株是产生结构独特且具有生物活性的抗炎代谢物的丰富来源。从优化后的GYM I发酵培养基中分离出五种次级代谢产物，其中新化合物1和已知化合物5通过调节肺泡上皮细胞和巨噬细胞模型中的GSK3β/NF-κB信号轴发挥强效抗炎作用。这些发现拓宽了链霉菌属的分类多样性，并为药用植物相关放线菌作为新型免疫调节天然产物发现的重要资源提供了有力证据。
