《Molecules》：Dual-Crosslinked Gelatin/Chondroitin Sulfate Hydrogel Loaded with Curcumin Liposomes for Multifunctional Wound Dressing
编辑推荐：
摘要：尽管明胶因其生物相容性、可生物降解性和内在生物活性而被广泛用于伤口敷料，但在单一水凝胶体系中同时实现强韧的力学性能和多种生物功能仍然具有挑战性。在此，研究人员构建了明胶/氧化硫酸软骨素动态席夫碱网络，并进一步引入三缩水甘油胺作为共价交联剂，制备了一种具有
摘要：尽管明胶因其生物相容性、可生物降解性和内在生物活性而被广泛用于伤口敷料，但在单一水凝胶体系中同时实现强韧的力学性能和多种生物功能仍然具有挑战性。在此，研究人员构建了明胶/氧化硫酸软骨素动态席夫碱网络，并进一步引入三缩水甘油胺作为共价交联剂，制备了一种具有动态/共价双交联结构的明胶/氧化硫酸软骨素/三缩水甘油胺水凝胶。随后，采用微流控技术制备的姜黄素脂质体作为生物活性纳米填料被掺入其中，获得了多功能明胶/氧化硫酸软骨素/三缩水甘油胺/姜黄素脂质体复合水凝胶。该水凝胶表现出自愈合和可注射行为，这可能与网络中存在的可逆动态键有关。通过调节三缩水甘油胺含量，复合水凝胶实现了315千帕的拉伸强度、258%的断裂伸长率以及在60%应变下72千帕的压缩应力。此外，该水凝胶表现出持续的姜黄素释放、显著的抗氧化活性（对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼和2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸的自由基清除率分别为59.8%和83.98%）以及对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性（>99.99%），同时保持良好的细胞相容性。总之，明胶/氧化硫酸软骨素/三缩水甘油胺/姜黄素脂质体多功能复合水凝胶是一种很有前景的伤口敷料候选材料，但仍需进一步的体内研究来证实其临床适用性。
一、研究背景与意义
皮肤损伤会触发一系列复杂的伤口愈合过程，包括止血、炎症、增殖和重塑四个重叠且高度协调的阶段。细菌感染和过度氧化应激等不利因素会严重破坏这一有序过程。传统的伤口敷料如纱布和海绵仅能提供物理覆盖和渗出液吸收，无法主动参与或调控伤口愈合过程。水凝胶作为一种具有三维多孔结构的高分子材料，因其与人体细胞外基质高度相似的结构，近年来在伤口敷料领域引起了广泛关注。
在众多水凝胶基质材料中，明胶因其优异的生物相容性、可生物降解性和内在生物活性而展现出独特优势。它保留了胶原蛋白中丰富的细胞识别基序，如精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列，有助于细胞的粘附、增殖和迁移。然而，纯明胶水凝胶固有的局限性在于其较差的力学性能，并且缺乏对伤口微环境的主动调控功能，因此无法满足复杂伤口修复的多功能需求。此外，水凝胶敷料在使用过程中容易受到外部机械应力的损伤，因此需要具备自愈合能力。这种特性通常通过水凝胶网络中的可逆动态共价键实现，其中亚胺键因其温和的形成条件和高度可逆性而应用最广。研究人员常将明胶与氧化多糖结合，通过席夫碱反应构建动态交联网络。在多种天然多糖中，硫酸软骨素作为细胞外基质的关键成分，通过抑制促炎细胞因子的过度表达而展现出优异的抗炎活性。氧化后，硫酸软骨素的邻二醇基团转化为醛基，得到氧化硫酸软骨素，其醛基可与明胶上的氨基反应形成动态席夫碱键，赋予水凝胶自愈合性能。
值得注意的是，单一的动态交联网络对力学强度的提升有限，且无法确保伤口的长期保护。引入化学交联剂构建双交联网络是增强水凝胶力学性能的有效策略。三缩水甘油胺是一种多功能、高反应活性的生物基小分子交联剂，可通过其环氧基团与明胶链上的氨基、羟基和羧基反应，形成稳定的共价交联网络。受其在生物组织工程中成功应用的启发，将三缩水甘油胺引入水凝胶网络有望避免传统交联剂潜在的细胞毒性，同时在保持良好生物相容性的前提下增强力学性能和结构稳定性。
为了实现伤口微环境的主动调控，敷料需要具备清除过量活性氧和有效抑制细菌感染的能力。姜黄素是一种从姜黄根茎中提取的天然多酚化合物，具有抗氧化、广谱抗菌和抗炎等多种生物活性。然而，姜黄素较差的水溶性和低生物利用度严重限制了其临床应用。为解决这一问题，各种递送系统已被探索用于姜黄素的包封。其中，脂质体作为磷脂双层囊泡，具有优异的生物相容性，能够高效包封疏水性药物，提高其溶解性和稳定性，同时实现持续释放，现已被广泛认为是最有前途的药物载体之一。
在本研究中，研究人员利用明胶、氧化硫酸软骨素和三缩水甘油胺构建了明胶/氧化硫酸软骨素/三缩水甘油胺双交联水凝胶，然后将通过微流控技术制备的姜黄素脂质体掺入水凝胶网络中，成功制备了多功能明胶/氧化硫酸软骨素/三缩水甘油胺/姜黄素脂质体复合水凝胶。具体而言，明胶上的氨基与氧化硫酸软骨素上的醛基发生席夫碱反应形成动态共价键，而三缩水甘油胺上的环氧基团与明胶和氧化硫酸软骨素的活性基团反应，形成稳定的共价交联网络。此外，环氧基团开环产生的羟基可与明胶和氧化硫酸软骨素的基团形成氢键，协同构建致密的三维网络结构。研究人员研究了该复合水凝胶的力学性能、流变学行为和溶胀行为，并评估了其药物释放行为、抗氧化和抗菌能力以及体外细胞毒性，以确定其适用于伤口敷料的潜力。
二、主要关键技术方法
- 1.
微流控技术制备姜黄素脂质体：采用微流控芯片，以大豆卵磷脂、胆固醇和姜黄素为有机相，去离子水为水相，通过蛇形微混合通道制备姜黄素脂质体。
- 2.
氧化硫酸软骨素的合成：使用高碘酸钠选择性氧化硫酸软骨素中的邻羟基碳-碳键，将其转化为二醛衍生物，并通过盐酸羟胺法测定氧化度。
- 3.
三缩水甘油胺的合成：通过环氧氯丙烷与氨水的反应合成三缩水甘油胺，并根据国家标准方法测定环氧值。
- 4.
双交联水凝胶的构建：将明胶与氧化硫酸软骨素混合形成席夫碱动态网络，再加入不同含量的三缩水甘油胺作为共价交联剂，最终负载姜黄素脂质体获得复合水凝胶。
- 5.
表征与测试方法：利用透射电子显微镜观察脂质体形态；利用傅里叶变换红外光谱和核磁共振氢谱表征化学结构；利用质构仪进行拉伸和压缩力学测试；利用扫描电子显微镜观察水凝胶截面形貌；利用流变仪评估流变学行为；利用紫外-可见分光光度计测定包封率、载药量、药物释放、抗氧化活性；通过平板计数法评估抗菌性能；通过MTT法评估体外细胞毒性。
三、研究结果
2.1 姜黄素脂质体的制备与表征
通过微流控技术制备的姜黄素脂质体呈现典型的球形形态，平均粒径为72.61纳米，多分散指数为0.087，zeta电位为-25.9毫伏。在25°C储存28天后，粒径略有增加至77.25纳米，且多分散指数保持较低水平，表明具有良好的储存稳定性。包封率和载药量分别达到81.80±0.14%和3.51%，高于传统薄膜水化法制备的姜黄素脂质体。
2.2 氧化硫酸软骨素和三缩水甘油胺的合成与表征
傅里叶变换红外光谱显示，氧化硫酸软骨素在1735cm-1处出现了新的羰基峰，核磁共振氢谱在9.13ppm处出现了醛基质子信号，证实了硫酸软骨素的成功氧化，氧化度为31.4%。三缩水甘油胺的傅里叶变换红外光谱显示了环氧基团的典型特征峰，核磁共振氢谱也验证了其结构，测得的环氧值为1.54mol/100g。
2.3 水凝胶的制备与表征
通过试管倒置法评估了水凝胶在37°C下的溶胶-凝胶转变行为。傅里叶变换红外光谱分析表明，复合水凝胶中环氧基团的特征峰消失，醛基峰减弱而碳氮双键伸缩振动峰增强，证实了三缩水甘油胺的环氧开环反应以及席夫碱反应的发生。
2.4 水凝胶的力学性能
随着三缩水甘油胺含量从0增加到3wt%，明胶/氧化硫酸软骨素/三缩水甘油胺复合水凝胶的拉伸强度从153千帕升至372千帕，断裂伸长率从198%增至269%。但当三缩水甘油胺含量增至6%时，过度交联导致脆性增加，拉伸强度和断裂伸长率分别降至143千帕和172%。因此，选择含3%三缩水甘油胺的配方（明胶/氧化硫酸软骨素/三缩水甘油胺-3）进行后续实验。负载姜黄素脂质体后，明胶/氧化硫酸软骨素/三缩水甘油胺-3/姜黄素脂质体水凝胶的拉伸强度略降至315千帕，断裂伸长率为258%，压缩应力在60%应变下达72千帕。经过10次循环加载-卸载测试，该水凝胶表现出良好的抗疲劳性和可恢复性。
2.5 水凝胶的微观形貌
扫描电子显微镜观察显示，所有水凝胶均呈现出相互连通的三维多孔网络结构。与明胶/氧化硫酸软骨素水凝胶相比，明胶/氧化硫酸软骨素/三缩水甘油胺水凝胶的网络更致密，且孔径随三缩水甘油胺含量增加而减小。姜黄素脂质体的加入对微观形貌影响不大。
2.6 水凝胶的流变学性质
动态频率扫描结果显示，所有样品的储能模量始终高于损耗模量，损耗因子低于0.2，表现出粘弹性固体行为。随着三缩水甘油胺含量的增加，储能模量显著上升，交联密度增大，平均网孔尺寸减小。负载姜黄素脂质体后，由于纳米填料与水凝胶基质的相互作用，储能模量和交联密度进一步提高。所有样品均表现出剪切稀化行为，明胶/氧化硫酸软骨素/三缩水甘油胺-3/姜黄素脂质体水凝胶可通过注射器连续挤出，展示了良好的可注射性。
2.7 水凝胶的溶胀行为
所有水凝胶样品均表现出优异的溶胀能力，在24小时内溶胀率超过480%。明胶/氧化硫酸软骨素/三缩水甘油胺-3/姜黄素脂质体水凝胶在48小时后的溶胀率达到638%，与未负载姜黄素脂质体的水凝胶相当。尽管吸水率高，但水凝胶仍保持结构完整。48小时溶胀后的质量损失为15.39±1.41%。
2.8 水凝胶的粘附和自愈合性能
明胶/氧化硫酸软骨素/三缩水甘油胺-3/姜黄素脂质体水凝胶对钢、纸、塑料、皮革、玻璃和丁腈手套等多种材料表现出良好的粘附性。搭接剪切试验测得其对猪皮的粘附强度为6.86千帕，超过了商用纤维蛋白胶。该水凝胶在37°C时对皮肤粘附牢固，但在10°C时粘附力减弱，表现出热响应可逆粘附特性。得益于可逆的动态席夫碱键，该水凝胶在无外界刺激下可实现自愈合，愈合效率达92.02%。
2.9 水凝胶的抗菌和抗氧化活性
姜黄素脂质体单独对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌率均超过99.99%。明胶/氧化硫酸软骨素水凝胶无抗菌效果。引入三缩水甘油胺后，明胶/氧化硫酸软骨素/三缩水甘油胺-3水凝胶对两种菌的抑菌率分别为68.78%和60.58%。负载姜黄素脂质体后，明胶/氧化硫酸软骨素/三缩水甘油胺-3/姜黄素脂质体水凝胶对两种菌的抑菌率均超过99.99%。在抗氧化方面，姜黄素脂质体在0.5mg/mL浓度下对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼和2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基的清除率均超过80%。明胶/氧化硫酸软骨素/三缩水甘油胺-3/姜黄素脂质体水凝胶对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼和2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸自由基的清除率分别达到59.8%和83.98%。
2.10 体外药物释放
在模拟生理条件下，明胶/氧化硫酸软骨素/三缩水甘油胺-3/姜黄素脂质体复合水凝胶可持续释放姜黄素长达180小时，初始12小时累积释放量为20.17%，之后缓慢持续增加，最终累积释放量达82.11%。相比之下，含有游离姜黄素的水凝胶在12小时内释放了36.42%，84小时后即达到80.48%的累积释放量。这表明脂质体封装有效抑制了初期突释并实现了持续递送。
2.11 体外细胞毒性
通过MTT法评估了水凝胶对人脐静脉内皮细胞的细胞毒性。所有样品在与细胞共培养24小时和72小时后，细胞存活率均保持在98%以上，且未观察到浓度依赖性细胞毒性，表明所有水凝胶样品均具有良好的体外细胞相容性。
四、讨论与结论
本研究设计了一种基于明胶的双交联复合水凝胶，该水凝胶具有动态/共价双交联网络并负载了脂质体包裹的姜黄素，用作多功能伤口敷料。明胶与氧化硫酸软骨素之间的席夫碱键赋予了水凝胶自愈合能力和可注射性，而三缩水甘油胺引入的共价交联显著增强了力学性能，实现了315千帕的拉伸强度、258%的应变和60%应变下72千帕的压缩应力。通过微流控技术制备的姜黄素脂质体的掺入，不仅赋予了水凝胶抗氧化活性和抗菌活性，还确保了在180小时内的可控药物释放，同时不损害水凝胶的细胞相容性。总体而言，这项工作提供了一种有效的策略，将优异的力学性能和多种生物功能整合到一个统一的平台中，成功克服了传统明胶水凝胶的固有局限性。该复合水凝胶显示出作为伤口敷料候选材料的潜力，未来将进行体内全层伤口愈合评估以进一步评估其临床转化前景。
