长期低温与常温运行下商业循环水养殖系统生物滤池的微生物群落分异及预测氮循环特征

《Microorganisms》：Long-Term Low- and Normal-Temperature Operation of Commercial Recirculating Aquaculture System Biofilters: Contrasting Microbial Communities and Predicted Nitrogen-Cycling Profiles

　　

本研究比较了两个商业循环水养殖系统（RASs）生物滤池在低温与常温运行模式下的微生物群落，采样覆盖四个季节。生物滤池中的微生物对RASs至关重要；低温是影响RASs生物滤池性能的重要环境胁迫因子，但生物滤池微生物如何响应低温仍不清楚。两个生物滤池总体上维持较低的氨和亚硝酸盐浓度，但低温生物滤池整体亚硝酸盐水平更高，且季节性升高更明显。低温生物滤池的细菌多样性较低、检测到的分类单元较少，群落组成发生显著变化。微生物群落与总有机碳（TOC）、碱度和无机氮密切相关。其共现网络较小且更集中，聚类程度更高、平均路径长度更短，表明微生物关联高度集中。预测氮循环谱也在两个生物滤池间存在差异：预测硝化谱无显著差异，而预测反硝化谱在低温生物滤池中较低。这些发现表明，两个商业系统具有明显不同的微生物群落，反映特定过程的差异。综上，成熟RAS生物滤池尽管群落大幅简化仍维持氨和亚硝酸盐去除，而各预测氮循环过程在两种运行模式下呈现不同的预测模式。

研究背景与问题：传统池塘养殖面临生态压力，高密度、低排放的循环水养殖系统（RASs，高密度低排放的水产养殖系统）成为重要养殖方式，其通过多个水处理单元实现高密度养殖下约90%的水回用。生物滤池（biofilter，依赖微生物去除毒性氮化物和有机物的水处理单元）是RASs核心组件，主要依靠氨氧化菌（ammonia oxidizers，将氨氧化为亚硝酸盐的微生物）、硝化菌（nitrifiers，参与硝化过程的微生物）和反硝化菌（denitrifiers，参与反硝化过程的微生物）等完成水处理。微生物群落对环境条件敏感，RAS设计和运行差异可导致群落不同，但商业RAS生物滤池微生物如何适应低温等环境条件仍不清楚。温度是影响微生物生长和代谢的关键因子，低温可影响膜流动性、底物利用和酶活性，也可通过塑造特定群落维持氮去除。已有研究表明群落组成变化不一定直接导致性能下降，但氮循环包含多个由不同功能群执行的过程，多样性—功能关系可能随过程和环境而异。因此，本研究比较长期低温和常温商业RAS生物滤池，探究其能否维持氨和亚硝酸盐控制、水质管理是否塑造多样性和群落结构、群落重组是否差异影响氮循环过程。

研究开展与结论意义：研究人员在两个商业RAS生物滤池中开展四季调查，比较低温和常温运行下生物滤池微生物群落及预测氮循环特征。结果显示，两个成熟生物滤池均维持较低氨和亚硝酸盐浓度，但低温生物滤池亚硝酸盐更高且季节变化更明显；低温生物滤池多样性较低、类群较少、群落和共现网络结构独特；预测硝化无显著差异，预测反硝化在低温生物滤池较低。该研究为商业RAS生物滤池中氮控制与微生物群落重组共存提供了现场比较依据。

关键技术方法：研究以Wanzefeng Fisheries Co., Ltd.（Rizhao, China）低温生物滤池和Qihao Biotechnology Co., Ltd.（Qingdao, China）常温生物滤池为样本来源；低温系统年均水温16 ± 2 °C，主养Oncorhynchus mykiss gairdneri，常温系统年均水温20 ± 2 °C，主养Maccullochella peelii。2017年5月、8月、11月和2018年2月四季采样，每个系统每季3个独立复合样本，采集水和生物介质，测定水质理化指标；提取生物介质DNA，扩增16S rRNA V3-V4区并用Illumina MiSeq测序；开展操作分类单元（OTU）聚类、α/β多样性、主坐标分析（PCoA）、层次聚类、置换多元方差分析（PERMANOVA）、线性判别分析效应量（LEfSe）、冗余分析（RDA）、分子生态网络分析（MENA）及FAPROTAX功能预测。

研究结果：
3.1 生物滤池水质：通过四季水质监测发现，两个生物滤池pH和溶解氧较稳定且无显著差异，pH均大于7.15；除Nor_win外NH₄⁺-N均低于0.1 mg/L，除Low_aut和Low_win外NO₂^?-N均低于0.1 mg/L，表明两个成熟生物滤池在常规运行下维持低氮浓度；但低温生物滤池NO₂^?-N显著高于常温生物滤池，常温生物滤池C:N显著更低，NO₃^?-N、总氮和可溶性反应磷显著更高；低温生物滤池NO₂^?-N在秋冬季最高，NO₃^?-N和总氮秋季较高。
3.2 低温和常温生物滤池微生物群落多样性：通过Shannon和Chao指数比较，常温生物滤池α多样性显著高于低温生物滤池；季节间两指数无显著差异。基于Bray–Curtis距离的层次聚类和PCoA将24个样本分为低温和常温两簇，PCoA解释55.7%总变异；PERMANOVA表明系统间群落差异显著（R² = 0.898，p = 0.001），季节间亦显著（R² = 0.251，p = 0.018），系统差异解释更多变异，且多元离散无显著差异。
3.3 低温和常温生物滤池微生物群落特征：通过Venn图和群落组成分析，常温生物滤池检测到29门442属，低温生物滤池检测到20门339属，低温生物滤池所有门均见于常温生物滤池。低温生物滤池以Proteobacteria（76.41%）、Bacteroidetes（12.08%）等为主；常温生物滤池以Proteobacteria（61.38%）、Chloroflexi（10.98%）、Firmicutes（7.58%）等为主。属水平上仅Rhodobacter为两组共有优势属，低温生物滤池中其相对丰度为28.25%，高于常温的10.02%；低温生物滤池优势属还包括Reyranella、Ferruginibacter、Acidovorax和Flavobacterium，常温生物滤池优势属主要包括Bacillus、Defluviimonas、Thiothrix和Hyphomicrobium。LEfSe以LDA>3.5筛选差异富集类群，发现4门、5纲、8目、8科和8属存在差异，Chloroflexi和Firmicutes在常温较高，Bacteroidetes和Proteobacteria在低温较高。
3.4 微生物群落与环境因子相关性：通过RDA分析，低温模型解释69.57%总变异，常温模型解释71.72%总变异；两个生物滤池中微生物群落均与碱度（ALK，水体缓冲酸化能力的指标）、总有机碳（TOC，反映有机碳负荷的指标）和NH₄⁺-N强关联，低温生物滤池中NO₃^?-N、常温生物滤池中NO₂^?-N分别与群落组成强关联。
3.5 低温和常温生物滤池微生物生态网络特征：通过MENA在统一阈值0.93下构建共现网络（co-occurrence network，基于类群丰度共变构建的关联网络），低温网络含167节点、268边、17子模块，常温网络含250节点、376边、26子模块，常温网络更大更复杂。低温网络正关联比例为57.09%，高于常温的51.33%；低温网络中心化程度、测地效率、平均聚类系数更高，平均路径距离更短，模块度更低，表明低温网络更聚集。
3.6 低温和常温生物滤池微生物群落预测功能谱：通过FAPROTAX（基于16S rRNA序列预测功能的工具）预测，两组预测功能谱在主成分分析中分为两组；主要预测功能包括化能异养、光能异养、生物地球化学循环、芳香化合物降解和暗硫氧化。进一步比较预测硝化和反硝化，预测硝化在两组间无显著差异，预测反硝化在常温生物滤池显著更高。

讨论总结：原文指出，两个成熟生物滤池氨和亚硝酸盐浓度全年较低，说明生物膜成熟并具有正常硝化能力。低温生物滤池秋季NO₂^?-N、NO₃^?-N和总氮峰值与秋季生物量最大、TOC峰值及溶解氧最低有关，表明除温度外，运行和环境条件同样影响氮去除效率。低温生物滤池多样性降低、检测类群减少且组成改变，原文将其与低温下温度敏感微生物生长受限、稀有或非硝化类群丢失以及冷耐受硝化类群形成相联系，从而在群落简化下维持氨和亚硝酸盐去除。优势类群变化显示群落重组，Proteobacteria在两组均占优势但低温更高，Chloroflexi和Firmicutes在常温更丰富；低温差异属Reyranella、Ferruginibacter和Acidovorax等与有机物降解和氮转化相关。TOC、ALK和无机氮与群落强关联，TOC升高可促进异养菌并抑制自养硝化菌，碱度可为硝化菌提供无机碳并缓冲pH，氮底物对硝化菌群具有选择压力。网络分析显示低温网络更小、更集中，原文将网络差异与多样性差异相联系，并指出正关联比例较高的解释仍需功能验证。功能预测显示预测硝化较保守而预测反硝化在低温较低，原文认为运行RAS中持续氨生成和以好氧条件为主可维持硝化功能群选择，低温长期运行可能促进生理适应或冷适应硝化菌替代，而硝化群落组成变化可与总体硝化维持共存。局限性包括：每个温度仅一个商业RAS，设施配置和运行管理可能混杂温度效应；V3-V4引物主要覆盖细菌，对古菌氨氧化菌等覆盖有限；功能谱为FAPROTAX预测而非qPCR直接验证，未来需结合硝化/反硝化速率和氮循环基因qPCR及宏基因组。

研究结论翻译：全年调查中，低温生物滤池总体维持较低氨和亚硝酸盐浓度，但亚硝酸盐高于常温系统且季节变化更明显。低温生物滤池具有较低的Shannon和Chao指数、较少的检测门和属，以及独特的分类和共现网络结构。预测硝化在两个系统间无统计学可检测差异，而预测反硝化在低温生物滤池中较低。综上，两个成熟商业生物滤池尽管微生物群落结构差异显著仍维持低氮浓度，而各氮循环过程在两种运行模式下呈现不同的预测响应模式。该比较为商业RAS生物滤池中氮控制与微生物群落重组共存提供了现场视角。