微繁殖、驯化及田间定植的阿根廷药用植物Larrea cuneifolia与野生植株的植物化学特征、NDGA积累及抗氧化和抗炎活性比较

《Plants》：Phytochemical Profile and Antioxidant and Anti-Inflammatory Properties of Larrea cuneifolia, a Medicinal Plant of Argentina, Obtained by Micropropagation, Acclimatized, and Established in the Field, Compared with Wild Plants

　　

Larrea cuneifolia Cav.（“jarilla macho”）是阿根廷干旱地区原生药用灌木，具有公认的抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗菌和抗真菌特性。然而，其生长缓慢和对野生采收的依赖限制了其可持续利用。本研究开发了L. cuneifolia离体繁殖（in vitro propagation）、温室驯化和田间定植的高效方案，并评估了微繁殖植株与野生个体的植物化学特征和生物活性。种子在无菌条件下萌发，节段外植体培养于补充不同植物生长调节剂（PGRs）的培养基上。吲哚-3-乙酸（IAA，1 mg/L）提供最佳总体响应，促进叶片产生、节发育和生根。组培苗在温室驯化期间存活率为95%，在阿根廷Valles Calchaquíes田间定植后存活率为80%。驯化伴随酚类化合物和去甲二氢愈创木酸（NDGA，Larrea属主要木脂素）积累增加。高效液相色谱–加热电喷雾电离–Orbitrap高分辨串联质谱（HPLC–HESI–Orbitrap–HR MS/MS）分析显示，繁殖植株保留了野生L. cuneifolia的特征植物化学谱，包括其富含木脂素的表皮上树脂。尽管代谢物丰度和多样性存在差异，抗氧化和抗炎活性仍与野生植株相当。这些结果表明，微繁殖L. cuneifolia植株在驯化和田间定植后保留其植物化学身份、NDGA积累能力、生物活性和代谢可塑性。因此，该方案为L. cuneifolia的迁地保护和可持续生产生物量提供了有前景的策略，具有潜在制药和化妆品应用，同时减少对自然种群的采收压力。

研究背景与目的：阿根廷植物多样性较高，但过度采收、城市化、气候变化和生态系统退化持续威胁原生植物种群，并造成植物遗传资源损失，多种特有种被列入阿根廷国家特有植物红色名录。Larrea cuneifolia Cav.（“jarilla macho”）为阿根廷原生药用灌木，分布于Monte生物地理省，海拔可达3000 m a.s.l.，在Valles Calchaquíes原住民社区有长期药用历史，涉及呼吸、肌肉骨骼和皮肤疾患，并报道有抗炎、抗风湿、抗菌、抗真菌、抗氧化和抗肿瘤等活性；其传统使用历史也使其在ANMAT Disposition No. 5418/2015框架下具有“传统用草药”注册潜力。然而，种子休眠、低出苗率（约一年后20%）和获得成熟植株周期长限制常规栽培；相关种L. tridentata报道4–6年开始结果、8–13年充分生殖成熟。野生采收依赖限制其可持续利用。微繁殖（micropropagation，离体无性繁殖技术）可能成为保护和扩繁手段，但研究人员认为此前尚无整合离体繁殖、温室驯化和田间定植的完整方案。因此，该研究旨在建立L. cuneifolia离体繁殖、驯化及田间定植方案，并评估繁殖植株是否保留野生植株的植物化学特征和生物活性，以支持迁地保护和可持续生物量生产并减少野生采收压力。

关键技术方法（不超过250字）：种子采自阿根廷Ampimpa, Amaicha del Valle（Tafí del Valle Department, Tucumán, Argentina）1960 m a.s.l.（26°35′33″ S；65°55′00″ W）2022年2月的自然种群，10株成年植株果实混合，凭证LIL 618.708；野生叶来自同种群5株独立成年植株。研究人员以无菌种子萌发建立8周龄无菌苗，取双节段外植体，在1/2 MS培养基中加入不同植物生长调节剂（PGRs）培养60 d，记录叶数、节数、生根和愈伤；随后进行温室驯化，并将11月龄组移入Ampimpa田间监测1年。植物化学采用60%乙醇超声提取叶粉、氯仿短时洗叶表，Folin–Ciocalteu法测总酚、AlCl₃法测总黄酮，HPLC–HESI–Orbitrap–HR MS/MS鉴定代谢物，HPLC-DAD定量NDGA；以ABTS^•+、H₂O₂清除和XO抑制评价活性；统计用R。

研究结果：
2.1. Germination（萌发）：通过无菌萌发试验，记录到81%萌发率和2.65 d平均萌发时间；种子在无预发芽处理下萌发较高，原文提示该批种子休眠水平可忽略，并认为研究间差异可能与种子来源、发育环境、成熟度、储藏条件或种群休眠强度自然变异有关。
2.2. In Vitro Induction and Multiplication and Rooting of Shoots（离体诱导、增殖与生根）：通过双节段外植体在不同PGRs组合下培养60 d并以形态指标和PCA分析，发现外植体响应受PGR类型、浓度和培养时间影响；IAA 1 mg/L总体最佳，叶数14.44 ± 5.12、节数7.38 ± 3.56，生根率62.5%虽低于KIN 0.25 mg/L的88%和IAA 1.5 mg/L的80%，但成对比较无显著差异；该种在增殖中可自发生根，无需单独生根阶段；KIN表现较好，BAP处理总体最差（最高浓度除外），IBA+BAP低于对照。PCA前两主成分解释62.3%变异，IAA 1 mg/L与叶数和节数相关，NAA 1 mg/L及BAP 2、4 mg/L与愈伤形成较相关；结论为IAA 1 mg/L在营养生长和根形成间平衡最佳，适于后续驯化。
2.3. Ex Vitro Acclimatization（离体后驯化）：通过温室驯化和田间定植存活监测，温室驯化存活率95%，植株形态正常、根系健壮；移栽至Ampimpa 1960 m a.s.l.田间后存活率80%，表明逐步驯化可保证较高存活并适应更严格田间条件。
2.4.1. Total Phenolic and Flavonoids Content（总酚与总黄酮含量）：通过Folin–Ciocalteu法和AlCl₃法测定不同阶段叶提取物，总酚从2月龄离体植株（MP-2）2440 μg GAE/mL升至温室8、11、15个月的3140、7020、8790 μg GAE/mL，田间4个月后降至7370 μg GAE/mL；野生幼株和成株分别为7190和7800 μg GAE/mL。表皮上树脂酚类贡献从8个月28.9%升至11–15个月约49–51%，田间降至40.9%，野生仅18.4%和18.1%。总黄酮在温室8个月最高，随后下降；树脂黄酮在11–15个月约占68%，田间和野生显著降低，野生约10–13%。结论为驯化影响酚类总量及其在表皮上树脂与其他叶部组分间的分配，显示酚类代谢活跃且可塑；原文指出环境变量未独立控制，不能确定单因素贡献。
2.4.2. Recovery of NDGA Accumulation（NDGA积累恢复）：通过HPLC-DAD定量，NDGA在MP-2为8.0 mg/g DW，温室8和15个月升至66.8和101.2 mg/g DW，田间（11个月温室+4个月田间）达112.2 mg/g DW，约为野生幼株94.6 mg/g DW的1.2倍（高18.6%），从MP-2至田间约增加14倍。结论为微繁殖未限制NDGA生物合成能力，驯化和田间定植后NDGA积累恢复甚至超过野生幼株；原文认为差异可能与发展阶段、驯化历史和環境条件共同有关，但因未独立评估，具体机制不能确定；Barrera et al. (2025)报道的昼夜和季节变化支持该种特化代谢可塑性。
2.4.3. Comparative Phytochemical Profiling of Wild and Micropropagated L. cuneifolia Plants（野生与微繁殖植株比较植物化学谱）：通过HPLC–HESI–Orbitrap-HRMS/MS非靶向分析，田间微繁殖植株检测并暂定鉴定29种代谢物，野生植株40种；野生多样性较高，尤其酚酸和黄酮；两组共享酚酸、甲基化黄酮、芪类和木脂素（lignans，酚类次生代谢物）及多种NDGA相关化合物。木脂素和甲基化黄酮为Larrea属化学分类标志。结论为微繁殖、驯化和田间定植后仍保留大部分特征植物化学谱；因未在同条件分析真实标准品，注释按Schymanski等分类为暂定Level 3；差异可能与发展史、环境历史和自然条件暴露时间有关，但不能建立因果。
2.4.4. Lignan Composition of the Epicuticular Resin and Its Ecological Significance（表皮上树脂木脂素组成及生态意义）：通过氯仿短时洗叶表并分析，野生和微繁殖植株叶表洗液几乎仅含木脂素，未检测黄酮和酚酸；与L. tridentata中NDGA及相关木脂素约占树脂酚类80%、总树脂40–50%的报道一致。结论为木脂素被主动分泌至叶表，构成L. cuneifolia保护性树脂主要化学成分；微繁殖保留木脂素分泌机制，可能有利于田间定植；该树脂被提出可降低角质蒸腾、 attenuate紫外辐射、抵御植食者和病原并借助木脂素抗氧化活性防止暴露组织氧化降解。
2.5. Antioxidant and Anti-Inflammatory Activity（抗氧化与抗炎活性）：通过ABTS^•+、H₂O₂清除和XO抑制实验，微繁殖叶乙醇提取物ABTS^•+清除SC₅₀为3.96 ± 0.08 μg GAE/mL，温室11个月后田间定植植株为4.56 ± 0.12，野生幼株为4.90 ± 0.09 μg GAE/mL；田间植株H₂O₂清除与同地区野生幼株相似；XO抑制以温室驯化植株最高（IC₅₀ = 3.41 μg GAE/mL），田间和野生植株IC₅₀为4.06–4.17 μg GAE/mL。结论为抗氧化和抗炎活性在微繁殖、驯化和田间定植后保持，且不严格平行于总酚或NDGA浓度，原文提示活性由酚类组分定性组成及化合物间协同或加和作用共同决定；活性可归于奎宁酸、3,4-二羟基氢化肉桂酸、eriodictyol、isorhamnetin、hispidulin、di-O-methylquercetin及木脂素等。

讨论与结论总结：该研究支持微繁殖结合温室驯化和田间定植可作为L. cuneifolia迁地保护与可持续利用策略；繁殖植株在驯化和定植中逐步恢复酚类与NDGA合成，保留属特征植物化学指纹、表皮上树脂分泌及抗氧化和抗炎活性。原文同时指出环境因素未独立控制、代谢物注释为暂定、需长期控制环境比较以明确植物年龄、环境暴露和繁殖历史贡献，并需进一步确定各化合物贡献及酚类、黄酮、木脂素和萜类等间可能的加和或协同作用。

研究结论（译）：本研究首次证明，Larrea cuneifolia的微繁殖不仅能够实现高效克隆繁殖，而且保留该物种的植物化学和生物学特征。在温室驯化及随后田间定植过程中，植株逐步恢复合成酚类化合物和NDGA的能力，同时保持该属特有的植物化学指纹。结合近期对L. cuneifolia野生种群所描述的季節和昼夜代谢可塑性，本研究结果表明，该物种在微繁殖和田间定植后仍保留调节其特化代谢的显著能力，同时保持其特有植物化学身份。此外，驯化植株的抗氧化和抗炎特性与野生个体相当，表明离体繁殖不会损害生物活性代谢物的产生。总体而言，这些发现表明，所开发的方案是保护L. cuneifolia的一种有价值策略，并提供植物化学标准化的可持续植物材料来源，具有潜在制药或化妆品应用。未来将进一步研究以确定各化合物的贡献，以及酚类化合物、黄酮、木脂素和其他成分（如萜类）在抗氧化和抗炎活性中可能的加和或协同相互作用。无疑，需要更深入理解L. cuneifolia植物化学物在炎症和氧化过程相关分子机制中的作用。