外源褪黑素浓度对杂交柳（Salix matsudana × S. alba）盐胁迫缓解的生理评价与转录组分析

《Plants》：Effects of Exogenous Melatonin Concentration on Salt Stress Alleviation in Salix matsudana × S. alba Assessed Through Integrated Physiological Evaluation and Transcriptomic Analysis

　　

盐胁迫限制杂交柳（Salix matsudana × S. alba）幼苗的建植。外源褪黑素（MT）可缓解植物盐胁迫，但其在杂交柳中的浓度依赖效应仍未充分表征。本研究在3个NaCl水平和5个MT浓度下评估生理响应，随后对代表性处理进行转录组分析。在6‰ NaCl下，0.5 mmol L^?1 MT在三个采样时间显著降低相对电解质电导率（REC）和丙二醛（MDA）含量，并在最终采样提高总叶绿素（Chl）、脯氨酸（Pro）和可溶性蛋白（SP）含量及抗氧化酶活性，相对于仅盐处理。基于主成分分析（PCA）并由相关性分析支持的综合生理评价在6‰ NaCl下将0.5 mmol L^?1排名最高，0.3 mmol L^?1排名第二，而1.0 mmol L^?1总体上未提供进一步改善。与未处理对照相比，6‰ NaCl加0.5 mmol L^?1 MT处理显示涉及植物激素信号转导及淀粉和蔗糖代谢的转录变化。定量逆转录PCR（qRT-PCR）对9个候选基因的RNA测序（RNA-seq）趋势提供广泛支持。这些发现证明浓度依赖的生理保护作用，并鉴定用于研究杂交柳中MT相关盐胁迫缓解的候选通路。

研究背景：土壤盐渍化威胁植被建植和生态修复。全球约1.381 billion ha、即10.7%的土地受盐影响。过量Na⁺和Cl^?积累可直接损伤细胞，并扰乱K⁺、Ca²⁺等必需元素的吸收、运输和区隔，破坏离子与养分稳态；盐诱导的氧化还原失衡可造成活性氧（ROS）过量积累，引起膜脂过氧化、蛋白损伤、叶绿素降解和光合效率下降。植物可通过离子排除与液泡区隔、渗透调节、抗氧化防御、植物激素信号和胁迫相关基因表达维持稳态，但其有效性受物种、组织、胁迫强度和持续时间影响。多年生木本植物跨季节经历盐度波动，幼苗耐盐性常决定后续存活、林分稳定和生态功能，但木本植物耐盐调控研究相对不足。杂交柳（Salix matsudana × S. alba）因生长快、易无性繁殖、根系发达和生物量高，在海岸带盐碱地生态工程中具应用潜力；但其耐盐并不意味着各盐度水平或胁迫阶段均能正常生长，仍需外源处理提高幼苗耐盐性。MT是植物内源吲哚胺，参与氧化还原调节、信号传导和胁迫适应，可作非酶抗氧化剂直接清除自由基并影响酶促抗氧化系统；木本植物中已有浓度依赖响应报道，但杂交柳中何种MT浓度可在不同盐胁迫强度和阶段提供较一致生理益处、并伴随何种转录特征仍不清楚。因此，研究人员开展浓度筛选与代表处理转录组分析，以连接浓度选择、多个生理性状证据和候选分子过程。

研究人员采用3个NaCl水平与5个MT浓度的因子设计，评估膜损伤、光合色素、渗透调节和抗氧化防御，并以相关分析和PCA进行综合生理评价，随后选取代表性处理进行转录组比较。研究结论表明，在6‰ NaCl下0.5 mmol L^?1 MT在测试浓度中表现较有利，1.0 mmol L^?1未提供进一步总体改善；转录组鉴定出植物激素信号转导及淀粉和蔗糖代谢等候选通路，但未分离MT特异性转录效应。该研究为温室条件下MT浓度选择提供实验依据，并提示其向其他生长阶段、盐条件和田间应用推广前需进一步验证。

关键技术方法：样本队列为南京林业大学白马校区温室盆栽一年生杂交柳（Salix matsudana × S. alba）幼苗；设置3个NaCl水平（0、3、6‰；S1–S3）×5个褪黑素（MT）浓度（0–1.0 mmol L^?1；M0–M4）共15处理，每处理3个生物学重复、每重复10株；第20、27、34天测定膜损伤、叶绿素、渗透调节和抗氧化酶指标，以全因子重复测量方差分析、相关性分析和综合生理评价分析；选取CK、S3M0、S3M2和S3M3进行转录组测序、de novo组装和注释，鉴定差异表达基因并行功能富集；用定量逆转录PCR验证9个候选基因，以ARF8为内参并采用2^?ΔΔCt法计算相对表达。

研究结果：
2.1 外源MT对盐诱导膜损伤和叶绿素水平的影响：通过不同NaCl和MT处理的重复测量生理测定，发现NaCl和MT显著影响相对电解质电导率（REC）、丙二醛（MDA）和总叶绿素（Chl）。在S3下，M3在三个采样时间均降低REC和MDA，最终REC为37.65%而S3M0为50.72%，MDA为31.09而S3M0为58.43 nmol g^?1 FW；M4的REC高于M3，且未进一步改善Chl。最终采样时S3下M2和M3的Chl高于M0，M3达1.80而M0为1.18 mg g^?1 FW，M4与M0无显著差异。S2下M3降低REC主要见于第27天，S1下M4增加REC。结论是MT效应随盐强度和采样时间变化，M3在S3下膜保护较一致。

2.2 外源MT对叶片渗透调节相关化合物和抗氧化酶活性的影响：通过叶渗透调节物和抗氧化酶测定，S3下M3在三个时间提高脯氨酸（Pro），最终较M0增加21.6%，而M4降低Pro；最终S3下M2–M4的可溶性糖（SS）高于M0，M4最高且高于M3；最终M3的可溶性蛋白（SP）最高并高于M0和M4。S3下M3在第27和34天超氧化物歧化酶（SOD）高于M0，最终M4高于M0但低于M3；M3的过氧化物酶（POD）在三个时间高于M0，最终高于M4。S2下较高MT多与较高SS和SOD相关，M4在三个时间SP和POD高于M0；S1下差异较小。结论是M3在S3下形成较优渗透调节和抗氧化酶谱，但SS响应与其他性状不同步。

2.3 综合生理评价支持选择有利MT处理：通过治疗均值相关分析和主成分分析（PCA），最终REC与MDA强正相关（r=0.87），二者与Chl反向；SP、SOD和POD变化较一致，SS与REC和MDA仅弱相关。PC1和PC2分别解释63.7%和20.8%变异，合计84.5%；PC1与REC和MDA负关联，与Chl、Pro、SP、SOD和POD正关联。S3下M3沿PC1与M0和M4分离，M4虽SS较高但未同时维持低膜伤和高Chl；方差加权综合评分显示最终采样M3在S2和S3均最高，S3下M2第二，M4明显低于M3。结论是综合生理评价支持M3为较一致有利处理，尤其在S3下。

2.4 盐胁迫和MT处理下总体转录组变化：通过选取CK、S3M0、S3M2和S3M3进行RNA测序（RNA-seq），12个文库获83.15 Gb clean data，Q30高于93.99%，mapping率为74.48%–79.71%；组装获125103个unigenes和249888个transcripts，BUSCO完整度为73.2%和89.8%，64.11%的unigenes获功能注释。相对CK，S3M0、S3M2和S3M3分别鉴定6372、7017和6193个差异表达基因（DEGs），均以上调多于下调，S3M2最多而S3M3最少，共享4184个，独特分别为984、1317和699个；基因本体（GO）分类相似；京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集显示植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢、氮代谢和苯丙烷生物合成等。结论是严重盐胁迫及MT处理相对CK呈现共享和特有转录变化，后续聚焦激素信号和糖代谢。

2.5 激素信号和糖代谢相关基因表达模式：通过S3M3相对CK的KEGG映射分析，123个DEGs映射植物激素信号转导，其中8个AUX/IAA成员上调、SAUR成员双向变化；脱落酸（ABA）相关PP2C 22个和ABF 13个下调，PYL成员方向不一。88个DEGs映射淀粉和蔗糖代谢，下调多于上调；海藻糖磷酸合酶（TPS）19个下调、2个上调，淀粉酶和异淀粉酶（ISA）相关基因下调，部分β-葡萄糖苷酶相关基因上调；注释到1439个候选转录因子（TF），隶属33个家族。结论是该处理状态涉及激素信号和糖代谢多成员表达调整；因对比包含盐和MT，解释为S3M3处理状态特征而非MT特异效应。

2.6 候选基因表达模式的qRT-PCR验证：通过定量逆转录PCR（qRT-PCR）验证9个候选基因，与RNA-seq主要趋势大体一致：TRINITY_DN1665_c0_g1、TRINITY_DN11618_c1_g1、TRINITY_DN55700_c0_g1和TRINITY_DN112041_c0_g1在S3M0、S3M2和S3M3低于CK；TRINITY_DN4814_c0_g1、TRINITY_DN1696_c0_g1和TRINITY_DN12626_c0_g1在MT处理较高；TRINITY_DN1696_c0_g1和TRINITY_DN12626_c0_g1最高在S3M2、随后在S3M3下降，TRINITY_DN2318_c0_g1和TRINITY_DN4045_c0_g1也在S3M2较高。幅度和部分排序有差异。结论是qRT-PCR支持方向趋势并显示基因特异响应。

2.7 生理和转录响应的假设生成工作模型：通过构建整合生理比较（S3M3 vs S3M0）和转录比较（S3M3 vs CK）的假设生成概念模型，盐胁迫下表现为较高REC和MDA、较低Chl；适当MT处理与降低膜伤、维持Chl及改变渗透调节相关化合物和抗氧化酶活性相关。S3最终M3较M0具更低REC和MDA、更高Chl、Pro、SS、SP及SOD和POD；但响应随NaCl水平和采样阶段变化，M4较高SS未伴随更优整体生理状态。转录候选主要涉及激素信号和淀粉蔗糖代谢。结论是模型提出可能联系，而非建立因果机制。

讨论部分总结：讨论指出MT缓解盐胁迫依赖浓度和环境条件。S3下M3持续降低膜伤，M4较高REC和MDA且未进一步改善Chl；类似浓度效应在其他植物有报道，但需基于杂交柳自身响应选择。盐强度影响明显：S2下M3相对M0的MDA和Chl改善不显著，S3下显著，且检测到NaCl×MT交互，故不同NaCl水平不应简单合并；S1下M4增加REC而未显著增加MDA，并降低早期Chl，提示高浓度可能影响膜透性和部分生理过程。膜伤、渗透调节与抗氧化方面，M3降低REC和MDA并维持Chl，REC与MDA同向且与Chl反向；SOD和POD与低膜伤同时出现，但ROS未直接定量，属间接证据；M4有时酶活较高但无等效膜保护；Pro和SP变化伴随较优生理谱，SP与SOD/POD相关但不表明因果；SS与其它性状不一致，单独SS不足以证明缓解。转录方面，S3M0、S3M2和S3M3均对CK比较，不能分离MT特异效应；激素信号和淀粉蔗糖代谢突出，氮代谢为Pro和SP提供候选背景，黄酮、MAPK及角质/木栓质/蜡质为候选过程；AUX/IAA上调不等于生长素信号输出增强，PP2C/ABF下调表示激素响应组件调整而非整通路激活或抑制；淀粉酶/ISA下调和TPS变化是联合处理下碳水代谢特征，不能直接解释SS积累；TF和候选基因需功能验证；S3M2的DEG数较多而S3M3综合生理更优，说明转录重编程幅度不能作为效果度量；模型仅提示联系，后续需在同盐度下直接比较MT处理与未处理、测定离子/激素/碳水、验证候选基因并开展生长生物量和田间试验。

研究结论部分翻译：外源MT对杂交柳（Salix matsudana × S. alba）盐胁迫缓解的效应取决于浓度和盐度。在6‰ NaCl下，0.5 mmol L^?1 MT在三个采样时间持续降低REC和MDA，并在最终采样改善叶绿素状况、Pro和SP含量及SOD和POD活性。综合生理评价支持该浓度在测试处理中为有利处理，而1.0 mmol L^?1未提供进一步总体改善。其在3‰ NaCl下的有益效应较不一致。与未处理对照的转录组比较鉴定了涉及激素信号及淀粉和蔗糖代谢的候选通路，但未分离MT特异性转录效应。这些发现支持在测试温室条件下进一步评估0.5 mmol L^?1 MT，而其对其他生长阶段、盐条件和田间环境的适用性仍需验证。