谷子瘟病拮抗细菌假单胞菌NR2065B9的分离鉴定及其生物防治潜力研究

《Plants》：Genome-Wide Resequencing Identification of Loci Associated with Early Maturity in Upland Cotton and Functional Validation of GhGATA9

　　

摘要专业翻译 由稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）引起的谷子瘟病是一种广泛传播的气传性病害，严重威胁谷子的可持续生产及产业发展。开发环境友好且无毒的管理策略已被广泛认可为建立可持续病害防控体系的核心前提。本研究从健康谷子根际土壤中分离到一株对P. oryzae具有显著体外拮抗活性的细菌菌株NR2065B9。通过形态学特征及16S rRNA基因序列同源性分析进行的分类学鉴定确认，该菌株属于西里西亚假单胞菌（Pseudomonas silesiensis）。对峙培养试验表明，菌株NR2065B9对P. oryzae的菌丝生长具有显著的抑制作用。离体叶片接种试验证明，菌株NR2065B9能够显著限制谷子叶片组织上瘟病病斑的扩展。田间试验进一步证实，与对照组相比，施用NR2065B9可降低谷子瘟病的发病严重度。综上所述，这些研究结果表明，拮抗菌株NR2065B9在谷子瘟病生物防治方面具有巨大的应用潜力，并可进一步开发为针对该病害的生物防治制剂的有前景的微生物资源。

论文解读

一、研究背景与意义

谷子（Setaria italica L.）是我国重要的营养密集型粮食作物之一。近年来，大规模连作种植、品种种植结构单一以及主栽品种对病原菌普遍感病等因素，共同加剧了谷子生产中病害爆发的严重程度。谷子瘟病由稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）引起，该病原菌属于子囊菌纲 Magnaporthales 目，是 Pyricularia 属中破坏性最强的成员。P. oryzae 可侵染谷子、水稻、小麦、大麦等多种禾本科作物及杂草，能侵染寄主植物几乎所有部位，在叶片、叶鞘、穗颈和穗部形成典型的梭形坏死病斑。该病害通常造成超过30%的产量损失，在严重流行年份可导致大面积减产甚至绝收，对高度感病品种的产量损失记录可达80%以上。目前，谷子瘟病已成为我国所有主要谷子产区广泛存在的地方性病害，对谷子产业的可持续健康发展构成持续而严重的威胁。

当前谷子瘟病防治主要依赖化学杀菌剂。化学防治虽具有快速抑制病害和田间实施便捷的优势，但长期大量施用合成杀菌剂可导致病原菌群体产生抗药性，且农药残留对食品安全、农业生态系统平衡和人类健康构成潜在风险。在此背景下，采用生物防治策略，特别是发掘和利用拮抗性生物防治微生物，已成为谷子瘟病可持续绿色管理的极具前景的关键替代方案。根际相关细菌是植物根际微生态系统中最主要的功能群体，构成生物防治菌剂发现的巨大资源库。从谷子根际生境中定向分离和筛选具有高生防潜力的功能菌株，对于推进谷子病害的可持续绿色防控策略具有重要的理论意义和实际应用价值。

二、研究内容与主要结论

本研究从健康谷子根际土壤中分离获得一株对谷子瘟病病原菌P. oryzae具有显著拮抗活性的功能菌株NR2065B9。经形态学特征结合16S rRNA基因系统发育分析，该菌株被分类鉴定为西里西亚假单胞菌（P. silesiensis）。体外对峙培养试验显示，菌株NR2065B9对P. oryzae菌丝生长的抑制率达98.77%。在混合培养基平板试验中，该菌株在PDA培养基上的抑制率为83.97%，在OTA培养基上的抑制率为91.05%。离体叶片接种试验表明，在全部六个供试谷子品种上，NR2065B9处理组均能显著限制瘟病病斑的扩展，无论寄主原有抗性水平如何，处理叶片上的病斑均保持为局限于接种点的小型坏死斑点。田间试验进一步证实，在四个供试品种上施用NR2065B9菌悬液均可降低谷子瘟病发病严重度，最低防治效果为4.02%。这些结果表明，菌株NR2065B9的防效不依赖于品种特异性抗性途径，其生物防治活性在不同宿主遗传背景下保持稳定。

三、主要关键技术方法

研究人员从河北省农林科学院谷子研究所试验站采集20份谷子根际土壤样品，采用平板稀释涂布法分离细菌，以P. oryzae DB165为指示病原菌，通过对峙培养法筛选获得9株具有显著拮抗活性的菌株，其中NR2065B9抑制效果最强。病原菌DB165通过单孢纯化技术从典型瘟病病叶中分离获得，经rDNA ITS序列系统发育分析鉴定为P. oryzae。拮抗菌株NR2065B9通过形态学观察、革兰氏染色及16S rRNA基因序列系统发育分析鉴定为P. silesiensis。研究采用了体外对峙培养试验、混合培养基平板试验、离体叶片接种试验和田间小区试验四级评价体系，系统验证了该菌株对谷子瘟病的防治效果。

四、研究结果

2.1 谷子瘟病病原菌的生长特性：研究人员从试验站采集的典型瘟病病斑中分离获得单孢纯化菌株DB165，通过菌落形态观察、分生孢子形态与大小测量、生长速率测定及rDNA ITS序列系统发育分析，将DB165鉴定为P. oryzae。该菌株在PDA培养基上平均生长速率为6.07 mm/d，在OTA培养基上为5.31 mm/d。

2.2 拮抗细菌的分离与鉴定：通过平板稀释涂布法从谷子根际土壤中分离细菌，以P. oryzae为靶标指示病原菌进行对峙培养筛选，共获得9株具有显著抑制效果的菌株。其中抑制活性最强的菌株NR2065B9经形态学观察为黄色圆形菌落、直杆状革兰氏阴性细菌，16S rRNA基因序列与P. silesiensis（NR156815）的相似性为99.44%，系统发育分析以100%自展值支持其与P. silesiensis亲缘关系最近，最终鉴定为P. silesiensis。

2.3 功能菌NR2065B9的体外拮抗活性：在PDA培养基上的对峙培养试验中，NR2065B9对P. oryzae DB165的菌丝生长抑制率达98.77%。在混合培养基平板试验中，NR2065B9在PDA培养基上的抑制率为83.97%，在OTA培养基上的抑制率为91.05%，而未经处理的对照组病原真菌表现出旺盛的菌丝生长和不受限制的径向扩展。

2.4 NR2065B9菌悬液对谷子瘟病的室内防治效果：在六个不同抗性水平的谷子品种离体叶片接种试验中，仅接种病原菌的对照组在各品种上均形成典型的瘟病症状，病斑沿叶脉组织向外扩展；抗病品种XJHG上病斑局限于接种点形成针尖状坏死斑点，感病标准对照品种Ci846上几乎所有接种点均形成扩展性病斑。NR2065B9处理组在全部六个品种上均显著降低了病害发生率，处理叶片上的病斑均保持为局限于接种点的小型坏死斑点，定量测量确认每个品种处理组的最终病斑面积均显著小于相应的病原菌单独接种对照组。

2.5 拮抗菌NR2065B9对谷子瘟病的田间防治效果：在JG19、JG38、JG39和JCG1四个品种的田间接种条件下，NR2065B9均抑制了谷子瘟病的发病严重度。与仅接种病原菌的对照处理相比，施用NR2065B9菌悬液在所有品种上的最低防治效果为4.02%。对照组植株在人工接种条件下均形成典型的瘟病病斑和症状。

五、讨论与结论

讨论部分指出，根际土壤中细菌与真菌群落的动态互作构成寄主植物的前线防御屏障。已有研究表明，多种细菌属在植物根际构成保守的防御联合体，可有效抑制根部病害进展。目前化学杀菌剂仍是作物病害管理的主导策略，但其大规模长期过度使用已引发一系列不良后果。本研究从谷子根际土壤中分离的P. silesiensis NR2065B9对P. oryzae的菌丝生长抑制率达98.77%，该种此前从未被报道具有对植物病原真菌的拮抗活性，这一强拮抗性能代表了区别于该种其他成员的功能性状。NR2065B9处理能显著限制P. oryzae在抗病和感病谷子基因型上的病斑扩展，其防效不依赖品种特异性抗性途径，可能通过直接抑制病原菌早期侵染过程或触发非基因型特异性的诱导系统抗性（ISR）通路发挥作用。田间试验证实该菌株在复杂开放田间条件下仍保持生防活性，但防效低于室内结果，这与已发表的生防菌田间验证结果一致，主要归因于田间环境中土著微生物竞争、温湿度波动、紫外线辐射及病原菌群体多样性等因素。未来需通过多地点多生长季田间试验进一步验证其防效稳定性，优化田间施用剂量和时机。

研究结论部分指出，本研究从健康谷子根际土壤中分离到P. silesiensis NR2065B9菌株，该菌株对谷子瘟病病原菌P. oryzae表现出显著的拮抗活性，菌丝生长抑制率达98.77%。与体外表现一致，田间试验结果表明施用NR2065B9菌悬液能够降低所有供试接种品种的谷子瘟病严重度。菌株NR2065B9经证实的体外和田间拮抗性能为谷子瘟病的生物防治提供了宝贵的本地细菌资源，表明该菌株具有开发为谷子病害管理高效生防候选菌剂的潜力。未来将通过转录组学和代谢组学整合多组学方法阐明NR2065B9的具体拮抗机制，并开展多地点连续田间试验系统验证其田间实际防治效果。