急性胰腺炎患者十二指肠黏膜真菌菌群（Mycobiota）的结构改变及其临床意义

《Journal of Fungi》：Alterations in the Duodenal Mucosal Mycobiota Associated with Acute Pancreatitis

　　

摘要专业翻译 目的： 肠道真菌在急性胰腺炎（AP）患者胰腺定植中的作用尚未完全阐明。本研究旨在确定AP患者十二指肠黏膜真菌菌群的结构变化、其与疾病的相关性及潜在作用。方法： 研究纳入32例AP患者和30例健康对照者。采集十二指肠降部黏膜样本，进行内转录间隔区（ITS）rRNA测序以表征真菌群落特征。通过生物信息学和统计学分析，评估群落差异、构建预测模型、评价临床相关性并预测真菌功能。结果： 两组间真菌群落的β多样性无统计学显著差异，而AP组物种水平的α多样性丰富度指数显著降低（p < 0.05，q > 0.05）。多个真菌分类群的相对丰度存在差异，AP组中候选共生菌减少，机会性真菌呈散在检出。基于真菌分类群的预测模型初步区分了AP患者与健康对照者（最大曲线下面积AUC = 0.79）。在AP队列内，多个真菌分类群与AP严重程度的炎症指标仅呈名义相关性，经FDR校正后均无显著意义。AP患者的真菌互作网络发生重塑，而核心代谢功能可能基本保持不变。结论： AP患者十二指肠黏膜真菌菌群呈现分类群特异性改变。差异真菌可能与疾病发展相关。尽管真菌菌群作为AP诊断和严重程度评估的候选生物标志物的潜力需在更大规模的独立队列中验证，本研究为AP患者微生态靶向干预提供了新方向。

论文解读

一、研究背景与目的

急性胰腺炎（AP）是一种以胰腺炎症为特征的突发性胃肠道疾病，临床表现复杂且早期难以预测病程走向。多数患者呈轻度自限性病程，但15%–20%的病例可进展为重症急性胰腺炎（SAP），相关死亡率高达30%。全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征源于SAP早期大量炎症因子的释放，而肠道功能障碍和胰腺坏死则在疾病后期逐渐发展。

胃肠道作为人体最大的器官，为共生微生物群提供了广阔的定植表面。研究表明，引起脓毒症和胰腺感染的微生物通常来源于肠道，尤其在SAP患者中更为明显。近年宏基因组研究的发展使人们日益认识到肠道菌群在人类健康和疾病中的重要作用。现有证据表明，不同病因、严重程度和并发症的AP患者，其肠道菌群与胰腺组织驻留微生物存在差异。肠道菌群失调在AP患者中普遍存在，表现为物种组成和功能多样性的改变。

肠道微生物群落由细菌和真菌群体共同构成，因此有理由推测肠道真菌向胰腺的移位和随后的定植与AP的发病机制相关。尽管肠道细菌在胰腺感染中的致病作用已得到确认，但肠道真菌在胰腺定植中的作用尚未被充分理解。AP患者临床管理中真菌感染发生率较高，尤其在SAP患者中更为突出。研究人员此前基于粪便样本的研究首次提供了AP患者粪便真菌菌群存在差异的经验证据。然而，实验研究表明急性坏死性胰腺炎的感染性胰腺坏死源于小肠而非结肠。粪便样本反映的是远端结肠的管腔内容物，而非近端小肠的黏膜相关群落，因为十二指肠和粪便微生物组在组成上存在显著差异。十二指肠在解剖学上与胰腺更为接近，其黏膜微生物群更可能通过逆行途径移位。在重症AP中，十二指肠黏膜屏障的破坏允许共生微生物移位进入胰腺坏死区域，且十二指肠中扩张的相同分类群可在胰腺坏死区域被检出。因此，十二指肠黏膜的变化对理解AP的发病机制具有更高价值。据研究人员所知，尚无研究专门表征AP中的十二指肠黏膜真菌菌群，本研究旨在填补这一空白。

本研究采用ITS rRNA基因扩增子测序技术，分析AP患者十二指肠降部黏膜中真菌菌群的结构和组成，并进一步探讨差异丰度真菌与多种临床和实验室参数之间的潜在相关性，以阐明肠道真菌菌群组成及其在AP发病和进展中的作用。

二、研究设计与方法概述

研究纳入2023年8月至2025年12月期间在上海交通大学医学院附属第一人民医院嘉定分院连续招募的32例AP患者（均在症状发作7天内就诊，符合2012年修订版亚特兰大分类标准诊断条件），以及30名接受常规胃肠镜筛查的健康体检者作为对照组。两组间年龄、性别、吸烟、饮酒和体质指数（BMI）无统计学显著差异。研究人员通过内镜获取十二指肠降部黏膜活检样本，采用优化的真菌DNA提取方案，使用ITS5/ITS2引物对ITS1区域进行扩增，在Illumina NovaSeq 6000平台进行双端250 bp测序。生物信息学分析使用QIIME2 2025.12和R 4.3.3软件，包括DADA2降噪、UNITE Release 9.0数据库分类注释、α/β多样性分析、Wilcoxon检验、LEfSe分析、随机森林分类模型构建、SparCC共现网络分析和PICRUSt2功能预测。

三、研究结果

3.1 临床特征

32例AP患者与30例健康对照者在年龄、性别、吸烟习惯、饮酒和BMI方面无统计学显著差异。AP队列包含11例轻度AP（MAP）、20例中度重症AP（MSAP）和仅1例SAP。

3.2 扩增子序列变体聚类与α多样性分析

共获得6,860,225条原始读段，经质量控制和去噪后保留5,125,972条高质量读段，最终纳入709个扩增子序列变体（ASV）。Venn图显示137个ASV为两组共有，294个为AP组独有，278个为对照组独有。稀释曲线表明测序深度充分。ASV水平上AP组的Chao1和Observed species指数较对照组下降但未达统计学显著；物种水平上AP组丰富度指数显著降低（Chao1，p = 0.013，q = 0.039；Observed species，p = 0.0041，q = 0.0249），但多样性、均匀度和覆盖度指数无显著差异。

3.3 β多样性分析

基于Bray–Curtis距离的主坐标分析（PCoA）显示两组间真菌群落结构无显著差异（Adonis检验p = 0.0633，R2 = 0.0134；ANOSIM检验p = 0.473，R = ?0.0021）。属水平层次聚类树展示了两组样本间的相似关系。

3.4 真菌菌群分类组成改变

两组真菌菌群在门水平均以子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）为主，分别占对照组83.83%和15.50%，AP组84.63%和15.23%。被孢霉门（Mortierellomycota）仅在对照组检出。纲水平上，散囊菌纲（Eurotiomycetes）在两组中均占最高比例（对照组51.2%，AP组51.4%），AP组座囊菌纲（Dothideomycetes）丰度低于对照组（4.3% vs 10.8%）。目水平上，AP组酵母目（Saccharomycetales）丰度增加（11.2% vs 5.0%），格孢菌目（Pleosporales）丰度降低（0.4% vs 6.5%）。科水平上，格孢菌科（Pleosporaceae）在AP组几乎检测不到（0.0% vs 4.5%）。属水平上，两组主要菌属为嗜热霉属（Thermomyces）、黑孢霉属（Nigrospora）、热子囊菌属（Thermoascus）、曲霉属（Aspergillus）和马拉色菌属（Malassezia）等。种水平上，白色念珠菌（Candida albicans）和嗜盐曲霉（Aspergillus penicillioides）仅在AP组检出而在对照组中缺失。

3.5 两组间真菌菌群的显著变化

Wilcoxon检验显示，门水平被孢霉门（Mortierellomycota）在AP组呈下降趋势（p = 0.04，q = 0.22）；目水平格孢菌目（Pleosporales）在AP组显著降低（p = 9.54 × 10^?6，q = 3.24 × 10^?4，Cliff’s δ = ?0.63，AUC = 0.19）；科水平格孢菌科（Pleosporaceae）同样显著降低（p = 3.37 × 10^?5，q = 1.82 × 10^?3，Cliff’s δ = ?0.56，AUC = 0.220）。种水平上，嗜盐曲霉（Aspergillus penicillioides）在AP组呈升高趋势（p = 0.03，q = 0.50），马拉色菌（Malassezia globosa）呈下降趋势（p = 0.02，q = 0.50）。ASV水平上，ASV59（注释为链格孢科（Alternariaceae），属于格孢菌目）在AP组显著降低（p = 3.06 × 10^?5，q = 0.02，Cliff’s δ = ?0.56，AUC = 0.22），ASV680（注释为曲霉科（Aspergillaceae））在AP组升高（p = 0.03，q = 0.41）。LEfSe分析鉴定出AP组富集的生物标志物为嗜盐曲霉（Aspergillus penicillioides，LDA = 4.20）和篮状菌属（Talaromyces，LDA = 4.01）；对照组富集的生物标志物包括座囊菌纲（Dothideomycetes，LDA = 4.53）、格孢菌科（Pleosporaceae，LDA = 4.34）、链格孢属（Alternaria，LDA = 4.34）、马拉色菌（Malassezia globosa，LDA = 3.97）等。

3.6 随机森林分析

基于嵌套5折交叉验证的随机森林分类模型在种、属、科、目水平的平均AUC分别为0.73、0.71、0.74和0.79，其中目水平模型表现最优（平均AUC = 0.79，SD = 0.038，95% CI 0.74–0.84）。递归特征消除（RFE）分析显示，种水平上链格孢属（Alternaria）、马拉色菌（Malassezia globosa）和黄青霉（Penicillium chrysogenum）在AP组丰度降低；属水平上链格孢属（Alternaria）和栓菌属（Trametes）在AP组降低而篮状菌属（Talaromyces）升高；科水平上格孢菌科（Pleosporaceae）在AP组显著降低；目水平上格孢菌目（Pleosporales）在AP组显著降低，与差异丰度分析结果一致。

3.7 共现网络与功能预测

SparCC共现网络分析显示，对照组网络跨越5个模块，包含4个跨模块连接节点（出芽短梗霉属（Aureobasidium）、暗孔菌属（Phlebia）、Naganishia和Meripilaceae incertae sedis，平均Pi = 0.479）；AP网络形成4个模块，无跨模块连接节点（平均Pi = 0.290），93.3%的AP节点（42/45）聚集在两个主导模块中。PICRUSt2功能预测显示，两组真菌功能主要涉及“生物合成”、“降解/利用/同化”和“前体代谢物和能量生成”。Level 2水平上丰度最高的通路包括“核苷和核苷酸生物合成”、“辅因子、辅基、电子载体和维生素生物合成”、“电子传递”、“磷酸戊糖途径”和“发酵”。两组间功能代谢通路无显著差异，但通路的功能贡献菌种存在差异：AP组中白色念珠菌（Candida albicans）、嗜盐曲霉（Aspergillus penicillioides）和黄曲霉（Aspergillus flavus）的相对丰度高于对照组，而未分类链格孢属（Alternaria）、马拉色菌（Malassezia globosa）、黄青霉（Penicillium chrysogenum）和杂色曲霉（Aspergillus versicolor）的丰度降低。

3.8 真菌菌群与临床和实验室指标的相关性

在AP队列内进行的Spearman相关性分析（经中心对数比（CLR）变换和FDR校正）显示，经多重检验校正后无任何真菌分类群与临床指标达到统计学显著相关。名义水平上，门水平子囊菌门（Ascomycota）（r = 0.37，p = 0.04）和被孢霉门（Mortierellomycota）（r = 0.35，p = 0.04）与血清脂多糖（LPS）浓度呈正相关，担子菌门（Basidiomycota）与LPS呈负相关（r = ?0.42，p = 0.02）；纲水平座囊菌纲（Dothideomycetes）与CTSI呈负相关（r = ?0.38，p = 0.03）；目水平粪壳菌目（Sordariales）与C反应蛋白（CRP）（r = ?0.45，p < 0.01）和CTSI（r = ?0.40，p < 0.01）呈负相关，毛霉目（Mucorales）与降钙素原（PCT）（r = ?0.38，p = 0.03）和淀粉酶（AMY）（r = ?0.38，p = 0.03）呈负相关；科水平毛壳菌科（Chaetomiaceae）与CRP呈负相关（r = ?0.47，p < 0.01），曲霉科（Aspergillaceae）与AMY（r = ?0.45，p < 0.05）和LPS（r = ?0.38，p = 0.03）呈负相关；种水平降钙素原（PCT）与季也蒙迈耶酵母（Meyerozyma guilliermondii）呈负相关（r = ?0.35，p < 0.05），CTSI与枝孢属（Cladosporium）sp.呈正相关（r = 0.35，p < 0.05），与Botryotrichum atrogriseum（r = ?0.38，p = 0.03）和Mycochlamys sp.（r = ?0.39，p = 0.03）呈负相关。

四、讨论总结与研究结论

讨论部分指出，AP与肠道菌群密切相关，肠道菌群失调的严重程度与AP患者的不良结局密切相关。既往研究已确立肠道细菌在AP发生发展中的作用，但肠道真菌的作用长期被忽视。念珠菌血症在AP患者尤其是SAP患者中临床常见，间接提示肠道真菌通过血行播散参与胰腺疾病进展。本研究未检测到两组间真菌群落β多样性的显著差异，PERMANOVA约束的R2仅为0.0134，表明组别归属仅解释了Bray–Curtis方差的1.34%。这一弱效应可能反映了以轻中度AP为主的队列特征（核心真菌结构得以保留）、低生物量黏膜真菌的高度个体间变异以及横断面采样设计。然而，物种水平α多样性丰富度指数的显著降低提示AP中可能发生细微的微生物群落结构改变。

格孢菌目（Pleosporales）及其代表科格孢菌科（Pleosporaceae）在AP组经FDR校正后仍显著降低，是本研究中最稳健的差异分类群。链格孢属（Alternaria）及其代谢产物在实验系统中被报道具有抗炎特性，包括抑制肿瘤坏死因子-α受体结合和抑制促炎细胞因子表达。白色念珠菌（Candida albicans）和嗜盐曲霉（Aspergillus penicillioides）仅在AP组检出，提示机会性真菌在肠道中的异常定植和扩张可能早在轻中度AP阶段即已发生，可作为后续真菌移位和感染并发症的潜在早期预警信号。共现网络分析显示AP重塑了十二指肠黏膜真菌关联模式，形成更紧密的模块封闭结构，缺乏跨模块连接节点，正向相关边在AP中心模块中更为集中，这一模式被广泛认为是微生物失调的标志。功能预测显示尽管整体功能谱相似，但执行这些功能的真菌可能从共生菌群转变为机会性病原体。

研究局限性包括：以轻中度AP为主的队列限制了对疾病严重程度关联的评估；十二指肠黏膜为低微生物生物量部位，背景污染可能引入偏差；PICRUSt2针对细菌16S rRNA基因数据开发，尚未针对真菌ITS测序进行正式验证；单中心横断面设计和有限样本量导致统计效力不足。

研究结论： 本研究揭示了AP患者十二指肠黏膜真菌菌群在分类群水平上统计学显著和名义显著的组成改变，尽管整体群落多样性和核心架构基本保留，凸显了黏膜真菌分类群作为疾病诊断和严重程度评估候选辅助生物标志物的初步潜力，但需在更大规模的独立队列中进一步验证。以维持黏膜真菌菌群稳态或恢复有益共生真菌为目标的干预策略，可能为降低AP进展过程中继发性侵袭性真菌感染风险和改善临床结局提供潜在研究方向。总体而言，这些发现为真菌菌群在AP发病和进展中的作用提供了新见解，并为未来的机制和转化研究奠定了基础。