《Journal of Fungi》：Serum Aspergillus Galactomannan Testing in Haematological Malignancies: An Exploratory Pilot Comparison of the Sōna LFA and VIRCLIA Monotest
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快速、单样本半乳甘露聚糖检测在血液学中的应用日益广泛，但直接比较研究仍然匮乏。这项前瞻性、单中心探索性初步研究比较了sōna曲霉半乳甘露聚糖侧向层析法（Lateral Flow Assay，LFA）与VIRCLIA?半乳甘露聚糖单项检测（GM-M
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快速、单样本半乳甘露聚糖检测在血液学中的应用日益广泛，但直接比较研究仍然匮乏。这项前瞻性、单中心探索性初步研究比较了sōna曲霉半乳甘露聚糖侧向层析法（Lateral Flow Assay，LFA）与VIRCLIA?半乳甘露聚糖单项检测（GM-Monotest）在45例血液系统恶性肿瘤成人患者中的表现，共获得97份配对血清样本。参考分类遵循2020年欧洲癌症研究与治疗组织/真菌病研究组教育与研究联盟（EORTC/MSGERC）框架，并进行了纳入GM-Monotest阳性结果的改良；LFA结果未参与分类判定。主要患者层面分析比较了4例确诊或拟诊侵袭性真菌病（invasive fungal disease，IFD）患者与34例无IFD患者。两种检测方法识别出相同的3例参考阳性患者（灵敏度75.0%；95%置信区间30.1–95.4%）。观察到的特异度LFA为91.2%，GM-Monotest为100%；3例无IFD患者出现LFA阳性/GM-Monotest阴性，1例拟诊病例两种检测均为阴性。Cohen's κ系数在患者层面为0.634，样本层面为0.754。将GM-Monotest结果从参考分类中排除后，两种检测的灵敏度均降至50.0%。这些初步发现表明两种检测具有实质性分类一致性，但尚不能确立诊断等效性；参考阳性患者数量少及纳入偏倚限制了结果的解读，尤其对GM-Monotest而言。需要采用独立参考标准的大样本研究进一步验证。
论文解读文章
一、研究背景与目的
侵袭性曲霉病（invasive aspergillosis，IA）是血液系统恶性肿瘤患者发病和死亡的重要原因，尤其是在诱导缓解化疗和异基因造血干细胞移植相关的长期深度中性粒细胞减少期间。尽管采用现代抗真菌治疗，院内死亡率仍然居高不下。早期启动抗真菌治疗可改善生存，因此及时诊断至关重要。然而，IA的临床和影像学表现缺乏特异性，传统诊断方法如组织病理学和无菌部位标本培养受限于灵敏度不足和获得确诊结果所需时间较长。非培养生物标志物因此成为该人群IA抢先诊断的核心手段。
曲霉半乳甘露聚糖（galactomannan，GM）是真菌生长过程中释放的多糖，其检测是最成熟的非培养生物标志物之一，已被纳入欧洲癌症研究与治疗组织和真菌病研究组教育与研究联盟（EORTC/MSGERC）发布的侵袭性真菌病（invasive fungal disease，IFD）共识定义中的真菌学标准。历史上支撑EORTC/MSGERC定义中血清GM标准的Platelia曲霉抗原酶免疫分析（GM-EIA）在血液学中显示了良好的诊断性能，汇总血清灵敏度和特异度分别约为76%和92%。然而，在接受霉菌活性预防或治疗的患者中其诊断性能可能下降，阴性血清结果不能可靠排除IA。此外，其传统微板格式通常需要批量检测，可能延迟结果报告。这些局限促使了对快速、单样本半乳甘露聚糖检测方法的日益关注。
sōna曲霉半乳甘露聚糖侧向层析法（LFA；IMMY公司）是一种快速、单样本的定量检测方法，使用sōna Cube数字读取器获得半乳甘露聚糖指数（GMI），制造商推荐的阳性阈值为≥0.5。曲霉半乳甘露聚糖抗原VIRCLIA?单项检测（GM-Monotest；Vircell公司）是一种自动化的单样本化学发光免疫检测。两种检测均可对单个标本进行检测，无需传统批量GM-EIA处理，可能促进常规实验室实践中更及时的检测。尽管LFA和GM-Monotest近期已有直接比较研究，但关于其诊断性能和检测间一致性的比较数据仍然有限。
由于半乳甘露聚糖本身构成EORTC/MSGERC定义的真菌学标准，针对该分类评估检测性能与直接比较LFA和GM-Monotest解决的是相关但不同的问题。配对比较两种检测可独立于参考分类提供检测间一致性的补充信息。基于此，研究人员开展了一项前瞻性、单中心探索性初步研究，旨在评估血清LFA和GM-Monotest相对于基于2020年EORTC/MSGERC框架并含血清GM检测特异性改良的研究参考分类的诊断性能，同时评估检测间一致性、探索不一致结果及两种检测定量指数值之间的关系。
二、研究设计与方法
该研究为前瞻性、观察性、单中心探索性初步研究，于2022年7月1日至2023年1月31日在土耳其安塔利亚健康科学大学安塔利亚培训与研究医院成人血液科进行，按照STARD 2015指南报告。连续纳入接受抗肿瘤治疗且存在中性粒细胞减少风险的成年血液系统恶性肿瘤患者（≥18岁）。按照科室常规监测方案，住院期间每周两次使用GM-Monotest进行血清GM筛查。纳入分析的患者至少有一份血清样本同时经GM-Monotest和LFA检测。排除入组前已诊断侵袭性曲霉病的患者，随访期间新发病例纳入分析。
三、研究结果
3.1 患者特征与IFD分类
共纳入45例患者：急性淋巴细胞白血病8例（17.8%）、急性髓系白血病12例（26.7%）、非霍奇金淋巴瘤14例（31.1%）、霍奇金淋巴瘤2例（4.4%）、多发性骨髓瘤6例（13.3%）及其他血液系统恶性肿瘤3例（6.7%）。共评估97份配对LFA和GM-Monotest检测。按研究参考分类，1例（2.2%）确诊IFD，3例（6.7%）拟诊IFD，7例（15.6%）可能IFD，34例（75.6%）无IFD。主要诊断准确性分析包含4例确诊/拟诊IFD患者和34例无IFD患者。
确诊IFD病例（P02）通过皮肤病变组织病理学检查显示真菌菌丝伴组织侵袭而确立。3例拟诊IFD患者中，2例（P01和P04）仅通过GM-Monotest阳性满足真菌学标准；无GM-Monotest结果时，这两例将基于宿主因素和相容的影像学发现被分类为可能IFD。另1例拟诊IFD病例（P22）有独立的真菌学证据——痰直接镜检显示有隔膜、锐角分支的菌丝，形态学符合曲霉属，但两种血清检测均为阴性。
探索性单变量比较显示，确诊/拟诊IFD患者较无IFD患者更常患有急性淋巴细胞白血病（75%对12%；p=0.015），中性粒细胞减少持续时间更长（中位数40天对4天；p=0.008）。8例（17.8%）患者住院期间死亡。确诊/拟诊IFD患者院内全因死亡率为50.0%（2/4），无IFD患者为11.8%（4/34）。
3.2 检测结果
患者层面，45例中6例（13.3%）至少一次LFA阳性，3例（6.7%）至少一次GM-Monotest阳性。样本层面，97份配对血清样本中8份（8.2%）LFA阳性，5份（5.2%）GM-Monotest阳性。
3.3 LFA和GM-Monotest的诊断性能
主要分析集（n=38）中，两种检测识别出相同的4例确诊/拟诊IFD患者中的3例，灵敏度均为75.0%（95%CI 30.1–95.4%）。观察到的特异度LFA为91.2%，GM-Monotest为100%。另1例拟诊IFD患者的所有连续检测两种检测均为阴性。3例无IFD患者LFA阳性而GM-Monotest阴性，造成特异度差异。灵敏度估计因仅4例参考阳性患者而缺乏精确性。GM-Monotest结果参与参考分类，引入潜在纳入偏倚。
3.4 LFA与GM-Monotest的一致性
Cohen's κ在患者层面为0.634，样本层面为0.754。患者层面3例不一致均为LFA阳性/GM-Monotest阴性，无反向不一致（McNemar精确检验p=0.250）。97份配对样本中，检测指数值呈弱正相关（Spearman's ρ=0.234；p=0.021）。探索性亚组分析中，34例无IFD患者的55份样本相关性可忽略（ρ=0.023），但至少一种检测阳性的8份样本相关性较强（Spearman's ρ=0.905；对数转换后Pearson's r=0.975）。
3.5 敏感性分析
将7例可能IFD患者也作为参考阳性时，参考阳性组为11例。两种检测灵敏度均降至27.3%（3/11），特异度LFA保持91.2%（31/34），GM-Monotest保持100%（34/34）。事后探索性阈值分析中，将GM-Monotest阈值提高至≥0.50和≥1.0不改变任何样本的二分类结果；阈值降至≥0.10时，患者层面灵敏度从75.0%（3/4）升至100%（4/4），特异度从100%（34/34）降至82.4%（28/34）。额外识别的参考阳性患者为拟诊IFD，最大GM-Monotest指数值为0.143。
将GM-Monotest结果从参考分类中排除后，2例患者（P01和P04）从拟诊重新分类为可能IFD并被排除，剩余1例确诊IFD、1例拟诊IFD和34例无IFD（n=36）。两种检测的患者层面灵敏度均为50.0%（1/2），低于主要分析的75.0%（3/4）。
3.6 治疗期间连续动力学
4例确诊/拟诊IFD患者的连续LFA和GM-Monotest指数值显示：P01两种检测均从阴性转为阳性随后降至各自阈值以下；P02两种检测首次检测即阳性并保持阳性直至随访结束；P04指数值随连续检测升高，两种检测在最终检测时转为阳性；P02和P04随访因患者住院期间死亡而终止；P22两种检测在整个随访期间均低于阈值，尽管被分类为拟诊IFD。
四、讨论与结论
本研究中血清LFA的灵敏度和特异度落在既往报道范围内。与既往研究比较：Alhan等人的前瞻性多中心研究在≥0.50阈值下报告灵敏度和特异度分别为75%和100%；诊断荟萃分析报告血清亚组汇总灵敏度和特异度为71%和92%；Fan等人的荟萃分析涵盖不同侧向流装置，血清检测相应估计为49%和91%，血液系统疾病患者为64%和89%。Küpper等人的直接平行比较研究中，使用制造商推荐阈值，基于单次阳性血清结果的特异度GM-Monotest为88.7%，LFA为85.9%；在确诊/拟诊IA的独立队列中，血清灵敏度GM-Monotest为42.6%，LFA为57.4%。
检测间一致性方面，LFA与GM-Monotest在患者和样本层面均显示实质性一致性。与既往LFA对比GM-EIA研究（White等人κ=0.698；Hoenigl等人κ=0.611）及GM-Monotest对比GM-EIA研究（Albert等人κ=0.56；Lamberink等人κ=0.449和0.764）相比，本研究的一致性程度处于相似范围。
定量相关性方面，本研究中LFA与GM-Monotest值的总体相关性弱（ρ=0.234），无IFD患者样本中可忽略（ρ=0.023），至少一种检测阳性的8份样本中相关性较强（ρ=0.905）。这一模式与Alhan等人报告的LFA与GM-EIA相关性模式（总体ρ=0.511；确诊/拟诊IA患者ρ=0.834；无IA患者ρ=0.104）大体相似。
阈值选择方面，使用制造商推荐的>0.20作为主要分析阈值。事后分析中降至≥0.10提高了灵敏度但降低特异度，与Lamberink等人的发现一致。值得注意的是，较低的≥0.10阈值应区别于2020年EORTC/MSGERC定义中纳入的血清GM阈值≥1.0，后者是在Platelia GM-EIA背景下确立的，而非针对GM-Monotest。
所有3例患者层面不一致均为LFA阳性/GM-Monotest阴性，发生在无IFD患者中，LFA指数值范围0.55至1.63。Küpper等人的研究显示，45.7%初始LFA阳性血清和11.1%初始GM-Monotest阳性血清在重新检测时未被确认，提示检测重复性需纳入考虑。反之，1例基于独立呼吸道标本镜检分类为拟诊IFD的患者两种检测均为阴性，该患者检测期间接受米卡芬净治疗；霉菌活性抗真菌暴露可能降低血清GM灵敏度，但菌丝形态仅符合曲霉属而非特异性，无培养确认时不能排除其他霉菌病因。
研究局限性包括：仅4例参考阳性患者导致灵敏度置信区间宽；单中心设计和样本量有限限制推广性；GM-Monotest结果参与2例拟诊病例的真菌学分类，其诊断性能未针对完全独立的参考标准评估，存在潜在纳入偏倚；未平行进行传统Platelia GM-EIA检测，无法进行直接三方比较；霉菌活性抗真菌暴露可能影响循环GM水平和检测灵敏度，但病例数不足以进行分层分析；样本层面分析包含非独立重复测量，未考虑患者内聚类。
结论：在这项针对血液系统恶性肿瘤患者的前瞻性探索性初步研究中，血清LFA和GM-Monotest显示实质性分类一致性但未完全一致。两种检测识别出相同的4例确诊/拟诊IFD患者中的3例，而3例无IFD患者出现LFA阳性/GM-Monotest阴性。参考阳性患者数量少及GM-Monotest结果纳入参考分类限制了诊断性能估计，无法得出等效性结论。两种检测应结合临床、影像学及其他真菌学证据进行解读。需要采用独立参考标准并与传统GM-EIA直接比较的大样本多中心研究，以验证检测特异性阈值并明确其诊断作用，同时考虑霉菌活性抗真菌暴露的影响。
