培养介质依赖性菌丝体代谢与生物活性定位：Fulvifomes fastuosus MSU245的基因组—代谢组特征

《Journal of Fungi》：Genomic and Metabolomic Characterization of Medium-Dependent Mycelial Metabolism and Bioactivities in Fulvifomes fastuosus MSU245

　　

研究人员表征了Fulvifomes fastuosus MSU245在麦芽浸膏肉汤（malt extract broth, MEB）或马铃薯葡萄糖肉汤（potato dextrose broth, PDB）中 submerged 菌丝体培养21 d的基因组草图和非靶向代谢组，并测定菌丝体与培养滤液组分的生物活性。超高效液相色谱–Orbitrap–串联质谱（UHPLC–Orbitrap–MS/MS）在正离子模式检测到2822个、负离子模式检测到1792个代谢物特征；这些特征计数包含同位素、加合物和源内碎片，因此并非化合物计数，以推定注释的脂质、有机酸和有机杂环化合物为主。探索性偏最小二乘判别分析（PLS-DA）在两种离子模式下均将两种介质分开（R²X = 0.72–0.79；R²Y = 1.00；留一法Q²Y = 0.91–0.92；6个样本中0个误分类）；由于每种介质仅3个生物学重复，该模型仅作描述性报告，介质效应主要由单变量统计支持。1374个差异特征中，844个在MEB中更丰富、530个在PDB中更丰富，多重检验校正后无通路保持显著。48.97 Mb基因组草图编码8个生物合成基因簇（BGCs），其中6个与萜类或萜类前体相关，并编码332个碳水化合物活性酶（CAZymes）结构域，符合白腐降解策略。生物活性具有介质和组分特异性：MEB菌丝体提取物在5 mg mL^?1处理48 h后将HeLa细胞活力降至51 ± 4%，而α-葡萄糖苷酶抑制仅见于MEB培养滤液（IC₅₀ 1.48 ± 0.14% v/v）。基因组与代谢组数据集为比较关系而非机制耦合：未将任何代谢物鉴定至结构水平，也未将任何生物合成簇与产物关联。因此，培养介质是推定注释的F. fastuosus代谢物谱的主要决定因素，抗增殖活性与α-葡萄糖苷酶抑制活性定位于MEB的不同组分。

研究背景：木腐多孔菌是森林生态系统中驱动碳和养分循环的重要担子菌，可分泌木质素水解酶和糖苷水解酶降解木质素、纤维素和半纤维素，同时具有丰富的特殊代谢。热带多孔菌的化学与培养代谢研究仍不足。Fulvifomes属包含50余种热带和亚热带白腐真菌，F. fastuosus（Lév.）Bondartseva & S. Herrera可在活木或枯木上形成大型多年生子实体；其子实体研究提示酚类、黄酮、萜类、生物碱、皂苷和单宁等化学成分及植物病原真菌抑制、α-葡萄糖苷酶抑制等活性，其中inoscavin A等曾被分离。但该种培养菌丝体的代谢、介质依赖变化及生物活性定位尚未见报道。 submerged发酵可控，但介质组成会影响碳氮供给、前体池、氧化还原平衡和特殊代谢途径，符合One-Strain-Many-Compounds（OSMAC）思路；基因组挖掘可提示BGCs，但真菌簇常弱表达或沉默，不能由基因组推断产物。因此，该研究旨在表征而非机制耦合F. fastuosus MSU245的基因组编码能力与已实现菌丝体代谢组，并确定培养介质如何塑造代谢组和生物活性。菌株分离自泰国Udon Thani省Wang Sam Mo县Phasuk镇Ban Kham Yang橡胶树种植园腐木，凭证标本MSUT7915和活培养物MSUCC245保存于Mahasarakham University。研究人员比较MEB与PDB静置培养21 d的代谢组，并分别测定菌丝体和培养滤液组分的抗增殖、α-葡萄糖苷酶抑制、抗氧化和一氧化氮（NO）抑制活性；结论是培养介质是推定注释代谢物谱的主要决定因素，抗增殖活性与α-葡萄糖苷酶抑制活性分别定位于MEB菌丝体组分和培养滤液组分；其意义在于从单一培养物识别出两个可分离的开发靶标，并提示介质可作为工艺变量。

关键技术方法：以来自泰国Udon Thani省橡胶树种植园腐木的F. fastuosus MSU245（保藏MSUT7915、MSUCC245）为材料，在MEB与PDB中28 °C静置培养21 d，每种介质3个生物学重复；采用UHPLC–Orbitrap–MS/MS非靶向代谢组，XCMS处理并以Metabolomics Standards Initiative 2–3级推定注释；用磺酰罗丹明B（sulforhodamine B, SRB）法测HeLa细胞活力、α-葡萄糖苷酶抑制、总酚/总黄酮、DPPH/FRAP及LPS刺激RAW 264.7的NO抑制与MTT活力；基因组用Illumina短读长、SPAdes组装，ITSx/BLAST鉴定，AUGUSTUS预测基因，antiSMASH预测BGCs，dbCAN-HMMER注释CAZymes，BUSCO评估完整性。

研究结果：3.1 非靶向代谢物谱以脂质和有机酸为主：通过UHPLC–MS/MS检测正离子2822个、负离子1792个特征，4576个特征注释到18个HMDB Class I，以脂质和脂质样分子、有机酸及衍生物、有机杂环化合物为主。3.2 质量控制确认分析重现性：通过混合QC样本显示正/负模式Pearson r分别≥0.992和≥0.994，QC在PCA中心聚集，CV>30%特征被剔除。3.3 培养介质是代谢物谱主要变异来源：通过PCA和探索性PLS-DA显示两种介质分离，R²X为71.8%/78.6%，R²Y=1.00，Q²Y=0.91/0.92且无误分类；因每组仅3重复，模型仅描述性，介质效应主要依据单变量统计。3.4 超过1300个代谢物特征不同：通过VIP>1.0、fold change>1.5或<0.667、名义p<0.05，得1374个差异特征，正模式795个（MEB高464、PDB高331），负模式579个（MEB高380、PDB高199）；层次聚类和K-means显示介质一致分块；部分>20倍差异应视为接近检测限的检出/未检出。3.5 通路分析显示广泛分布的介质依赖差异：通过KEGG过表征分析，仅正模式ABC transporters名义显著（p=0.043），负模式无显著通路，均未通过多重检验校正；GSEA无p<0.05通路，色氨酸代谢向PDB弱趋势。3.6 MEB菌丝体提取物降低HeLa细胞活力：通过SRB法，仅MSU245MEB-M呈浓度依赖，5 mg mL^?1下24 h为58.4 ± 4.4%、48 h为50.5 ± 4.1%，PDB菌丝体提取物48 h为77.5 ± 2.8%；培养滤液与未接种介质平行下降，提示基质效应。3.7 MEB培养滤液抑制α-葡萄糖苷酶：通过酶抑制试验，仅MEB滤液在2.5% v/v下抑制76.45 ± 2.42%，IC₅₀为1.48 ± 0.14% v/v；PDB滤液和两种菌丝体提取物无检测到抑制，表明两种活性定位不同MEB组分。3.8 酚类、黄酮和抗氧化随介质与组分变化：通过TPC/TFC、DPPH和FRAP，TPC最高为PDB滤液222.72 ± 5.62 mg GAE L^?1，TFC最高为PDB菌丝体提取物329.72 ± 10.73 mg QE L^?1，FRAP最高为MEB滤液64.30 ± 1.80 mg TE L^?1，DPPH最强为PDB菌丝体提取物IC₅₀ 25.37 ± 1.13 mg mL^?1；TPC与DPPH IC₅₀正相关（r=0.802），TFC与FRAP相关（r=0.682），所有终点ANOVA显著。3.9 非细胞毒性浓度下NO抑制微弱：通过LPS刺激RAW 264.7，10% v/v时五种制备使巨噬细胞活力<70%故不报告；0.25% v/v时活力102–118%，NO抑制≤10.4%，MEB滤液最高10.38%，MEB菌丝体提取物6.87%，其余≤3.5%。3.10 基因组草图支持菌株身份并揭示多样BGCs：通过Illumina组装得48.97 Mb、9043 scaffolds，BUSCO完整65.6%、碎片14.1%、缺失20.3%、重复27.6%；ITS 450 bp与F. fastuosus 99%一致；antiSMASH预测8个BGCs，4个萜类、2个萜类前体、2个NRPS相关（其一为NRPS-like/type-I PKS杂合），无MIBiG显著匹配，未检出ergoline途径基因。3.11 CAZymes支持白腐生活方式：通过dbCAN-HMMER注释332个结构域/320个蛋白，GH 173、GT 63、AA 57、CE 19、PL 15、CBM 5；含17个AA2 class-II过氧化物酶、8个AA1漆酶、19个AA3 GMC氧化还原酶、7个AA9裂解多糖单加氧酶及GH6/GH7纤维二糖水解酶，符合白腐特征。3.12 基因组编码近完整萜类骨架：通过MVA途径扫描，9步中8步存在，仅角鲨烯环氧酶ERG1未检出；含10个萜类/倍半萜合酶基因和94个细胞色素P450单加氧酶；LC–MS中501个特征注释为萜类或类固醇/异戊二烯脂质，其中117个差异，包括81个倍半萜、44个单萜、75个二萜、19个三萜及麦角甾烷类等。

讨论总结：讨论指出培养介质是代谢物谱主要变异来源，但每组3重复使多元模型仅具描述性；未记录菌丝干重，不能区分生物量差异与单位生物量代谢差异；全培养代谢组不能按组分分辨；特征水平名义p未校正；基因组碎片化且BUSCO完整度65.6%，基因和簇边界为暂定；注释仅MSI 2–3级；抗增殖仅单一HeLa细胞系且无良性对照。MEB菌丝体提取物抗增殖作用温和，不能称为强效或选择性抗癌；滤液抗增殖与未接种介质相当，强调介质对照的重要性。α-葡萄糖苷酶抑制来自MEB滤液而未接种MEB无抑制，但不能区分真菌直接分泌或转化介质成分；Singmahan et al.曾从F. fastuosus子实体分离inoscavin A等，MSU245滤液中未证实。酚类、黄酮、抗氧化和NO结果应视为探索性，TPC/TFC为操作定义，六组相关不宜作正式推断；非细胞毒性浓度下NO最高抑制仅10.38%，无显著抗炎证据。CAZymes组成与白腐生态一致，但不同研究注释策略不同，不宜定量比较。

研究结论翻译：引言设定的目标基本达成，但目标iv存在明确不足。研究人员组装并注释了基因组草图，获得8个候选BGCs，其中6个与萜类或萜类前体相关；332个CAZymes结构域以糖苷水解酶和class-II过氧化物酶为主；近完整MVA到三萜骨架含10个萜类/倍半萜合酶基因和94个P450s（目标i）。21 d MEB和PDB培养代谢组在4614个检测特征中1374个不同，844个在MEB更丰富（目标ii）。生物活性按组分定位：仅MEB菌丝体提取物降低HeLa活力（5 mg mL^?1、48 h至51 ± 4%），仅MEB培养滤液抑制α-葡萄糖苷酶（IC₅₀=1.48 ± 0.14% v/v），抗氧化和NO终点无生物学意义差异（目标iii）。检测到的化学类别，尤其501个注释为萜类或类固醇/异戊二烯脂质的特征，与基因组编码的萜类能力一致，但一致性是设计支持的限度：未将任何候选簇与产物关联，目标iv仅在数据集相容性层面回答。第一个预测获支持，MEB产生两种活性制备；第二个预测由基因组注释支持。实践上，结果从单一培养物识别两个可分离开发靶标：菌丝体组分作为抗增殖先导来源，无细胞滤液作为与餐后血糖控制相关的α-葡萄糖苷酶抑制剂来源；因活性滤液无需破坏菌丝体即可获得，更易放大，介质对比可直接作为工艺变量。未来应进行生物活性导向分级、标准品和NMR结构确认、长读长连续组装及两介质转录组、剂量反应和机制测试后再作治疗宣称。