初级纤毛通过分泌蛋白BUG-1介导C. elegans特异性神经元-胶质细胞附着

《Current Biology》：Primary cilia mediate specific neuron-glia attachments in C. elegans through the secreted protein BUG-1

　　

初级纤毛是信号枢纽，影响细胞生理的几乎各个方面。近期研究发现，哺乳动物大脑中的神经元初级纤毛可与胶质细胞形成广泛的附着，但这些附着如何形成以及发挥何种功能尚不清楚。纤毛缺陷可导致严重的神经系统疾病，凸显了理解神经元纤毛特殊功能的重要性。本研究利用秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的遗传筛选，确定了一种定型（stereotyped）纤毛-胶质附着如何形成，以及该附着如何影响纤毛钙信号。研究人员发现，两个感觉神经元（URX和BAG）利用其纤毛附着到特定的胶质细胞伙伴（ILsoL/R）。该附着需要BUG-1——一种大分泌蛋白，其精确地定位在纤毛-胶质附着位点。在缺乏BUG-1的情况下，神经元纤毛仍然存在，但始终无法附着到胶质细胞。结果，URX纤毛不能发生野生型神经元中所见的活性依赖性重塑，BAG纤毛则表现出感觉刺激诱发的钙内流减少和钙清除缺陷。本研究证明，纤毛能够选择特定的胶质伙伴进行附着，鉴定出一种介导这些附着的新蛋白，并展示了纤毛-胶质附着缺失对神经元信号传导的功能后果。研究人员提出，神经元初级纤毛不仅充当接收长距离信号的天线，还作为近距离细胞-细胞接触点，胶质细胞可能通过这种接触调节神经元信号传导。

初级纤毛广泛存在于神经元和胶质细胞表面，是影响细胞生理几乎所有方面的信号枢纽。近期在哺乳动物脑中的超微结构研究显示，神经元初级纤毛可与邻近胶质细胞形成广泛接触，但这些接触的分子基础、形成机制和功能意义尚不清楚。纤毛缺陷可导致严重神经系统疾病，纤毛相关基因表达异常与自闭症、精神分裂症、双相情感障碍、帕金森病和肌萎缩侧索硬化等疾病相关，但因果机制仍未阐明。因此，鉴定神经元纤毛的特化功能及其支持分子具有重要价值。

本研究以C. elegans的两个感觉神经元URX和BAG为模型，利用其与特定胶质伙伴ILsoL/R之间可重复的纤毛-胶质附着，解析了附着形成的分子机制及其对纤毛信号的影响。研究人员发现，该附着需要一种此前未表征的大分泌蛋白BUG-1b；BUG-1b精确地定位于纤毛-胶质附着位点，并由感觉神经元自身提供。在bug-1突变体中，纤毛存在但无法附着到ILsoL，导致URX纤毛丧失活性依赖性树突重塑，BAG纤毛则出现钙内流减少、钙清除异常以及纤毛内信号蛋白区室化改变。这项工作首次鉴定出介导纤毛-胶质附着的特异性分子，表明神经元初级纤毛不仅能接收远距离信号，还可作为近距离细胞接触位点，为理解纤毛相关神经系统疾病提供了新视角。

研究人员采用的主要技术方法包括：在mapk-15突变背景下利用EMS进行正向遗传筛选，以分离URX纤毛末端定位异常的突变体；通过SNP定位和全基因组测序鉴定突变基因；使用CRISPR-Cas9构建点突变、全基因缺失、结构域删除及内源荧光蛋白标签；结合FIB-SEM电子显微镜三维重建和荧光显微镜观察胚胎及幼虫的形态；使用GCaMP6f钙成像检测URX和BAG纤毛及胞体钙动态；并辅以CO₂回避和O₂行为学实验。所有线虫株系均以N2为背景。

**特异性的神经元-胶质附着通过两步机制形成**：通过胚胎FIB-SEM三维重建、荧光显微测量、遗传消融和胶质细胞特异性表达GRDN-1实验，研究人员发现URX和BAG树突末端在胚胎伸长开始时并不直接锚定于ILsoL，而是分别先与背侧CEP鞘胶质（CEPsh）和IL鞘胶质（ILsh）形成初始锚定，随后在幼虫阶段再与ILsoL形成成熟附着。因此，神经元-胶质配对是一个由引导胶质（guidepost glia）介导的两步过程。

**初级纤毛介导神经元-胶质附着**：利用daf-19/RFX突变体（纤毛缺失）结合细胞特异性回补实验，研究人员发现URX和BAG的树突延伸基本正常，但成熟附着缺失；URX末端不能离开背侧感觉束伸向ILsoL，BAG不能包绕ILsoL。在BAG中表达daf-19d可挽救附着缺陷。这表明初级纤毛在树突延伸完成后主动介导成熟附着的建立。

**BUG-1为纤毛-胶质附着所必需**：通过正向遗传筛选获得hmn356突变，定位到未表征基因T01D3.1，命名为bug-1。CRISPR-Cas9引入相同突变或全基因缺失均重现表型。bug-1编码分泌蛋白，长亚型BUG-1b为附着所必需。结构域删除实验显示，BUG-1b的碳水化合物结合蛋白和糖水解酶（CASH）结构域及表皮生长因子（EGF）样结构域对附着至关重要且部分功能独立，钙黏蛋白结构域影响较小；EGF缺失时ILsoL形成异常突起但未被纤毛包绕。

**BUG-1定位于纤毛-胶质附着位点**：将内源BUG-1b羧基端融合sfGFP后，发现其聚焦于URX和BAG纤毛以及全身每个感觉器官的神经元-胶质附着处。BUG-1b在胚胎2-fold期即表达，早于纤毛长出，并富集于将来发生附着的树突末端。在胶质消融后仍保留定位，且神经元特异性删除bug-1而非胶质删除导致附着受损，表明BUG-1b来自感觉神经元并在附着形成中发挥直接作用。

**纤毛-胶质附着是URX树突活性依赖性重塑所必需**：在bug-1突变体中，URX对急性O₂刺激的钙反应和动物急性行为反应未见明显改变；但在环境O₂（21%）条件下培养至第4天成虫时，URX树突末端的复杂分支显著减少，与ILsoL消融的表型相似。这说明纤毛-胶质附着主要影响URX对慢性刺激的结构可塑性，而非急性感受。

**纤毛-胶质附着对BAG纤毛钙动态至关重要**：用GCaMP6f记录CO₂刺激下BAG纤毛钙变化，野生型纤毛钙快速升高、峰值后下降，呈适应特征；bug-1突变体纤毛钙初始上升后仍缓慢增加，直至刺激结束才达峰，峰值略低，且清除受损，而胞体钙正常。此外，内源GCY-9和TAX-4在纤毛中的亚区室分布发生分离，GCY-9几乎只存在于bag区，TAX-4主要保留在stem区。这些结果提示纤毛-胶质附着对局部钙信号，尤其对持续刺激的应答至关重要。

讨论部分指出，以往研究已观察到纤毛与邻近细胞附着，但缺乏对其分子机制的了解。本研究利用C. elegans的定型解剖和强大遗传学手段，首次鉴定出介导纤毛-胶质附着的分泌蛋白BUG-1b，并证明胶质附着可调节纤毛的形态、分子区室化和钙信号。这种作用类似于胶质细胞在突触可塑性中的角色。纤毛-胶质附着可能也存在于肝脏胆管细胞、肾脏细胞和胰腺β细胞等组织，提示模式化的纤毛-细胞附着可能是动物组织中进化上古老且广泛影响生理的特征。研究结论是：神经元初级纤毛不仅充当接收远距离信号的天线，还作为近距离细胞-细胞接触位点；通过这种接触，胶质细胞能够调节神经元的信号传导。