可溶性间皮素（sMSLN）诱导中性粒细胞溶酶体生物发生并经TLR4-STAT3轴维持其长寿驱动肺癌脑转移

《Cell Reports》：Mesothelin-induced lysosomal biogenesis sustains neutrophil longevity to drive brain metastasis

　　

肿瘤相关中性粒细胞（TAN）富集是脑转移（BrM）的定义性特征和驱动力，而脑转移是实体瘤死亡的主要原因。然而，调控BrM中TAN富集的机制仍未明确。在此，研究人员证明，BrM细胞来源的可脱落可溶性间皮素（sMSLN）关键性地延长中性粒细胞存活，从而促进肿瘤细胞在脑内定植和生长。具体而言，sMSLN与中性粒细胞上的Toll样受体4（TLR4）结合，激活JAK2-STAT3通路。该激活促进溶酶体生物发生和功能，降低细胞活性氧（ROS）并抑制中性粒细胞凋亡。中性粒细胞清除或TLR4-STAT3阻断可消除sMSLN诱导的BrM进展。使用Anetumab靶向MSLN可有效减少TAN富集，将其与TLR4抑制联合可协同抑制肺癌BrM。研究人员的发现确立了肿瘤细胞来源的sMSLN在维持中性粒细胞长寿和驱动BrM中的关键作用，并突出sMSLN-TLR4轴作为脑转移肿瘤的有前景治疗靶点。

研究背景与问题：脑转移（BrM，肿瘤细胞经血行播散至脑内形成的继发灶）尤其是肺癌脑转移，是实体瘤相关死亡的主要原因，超过40%的肺癌患者发生颅内转移，而手术、立体定向放疗和系统靶向治疗等现有综合治疗 rarely 使中位生存期超过10个月，免疫治疗反应率仍不理想。肿瘤相关中性粒细胞（TAN，肿瘤微环境中被重编程的中性粒细胞）是BrM微环境的重要 orchestrator，可被招募至脑转移龛并表现为长寿、免疫抑制和促血管生成，但TAN在BrM中富集、转运、龛特异性功能重编程及脑适应机制尚不明确。间皮素（MSLN）在实体瘤中以细胞表面或分泌型表达，促进肿瘤细胞增殖和恶性转化，并是CAR-T治疗靶点，但其在肿瘤微环境（TME）重塑中的作用未明。为此，研究人员通过比较BrM与原发肿瘤的蛋白组学，寻找BrM富集的分泌因子，解析中性粒细胞长寿机制并探索靶向策略。

研究人员开展的研究与结论意义：该研究鉴定可脱落可溶性间皮素（sMSLN，MSLN经剪切释放的可溶形式）为BrM富集因子；sMSLN与中性粒细胞Toll样受体4（TLR4，模式识别受体）结合，激活JAK2-STAT3通路，促进溶酶体生物发生和功能，降低细胞活性氧（ROS，氧化应激相关分子），抑制中性粒细胞凋亡并延长其寿命，从而促进肿瘤细胞脑内定植和生长；清除中性粒细胞或阻断TLR4-STAT3可消除sMSLN诱导的BrM；Anetumab靶向MSLN可减少TAN富集，并与TLR4抑制协同抑制肺癌BrM。该研究将sMSLN-TLR4轴确立为BrM的机制性治疗靶点。

关键技术方法（不超过250字）：研究人员经连续心内接种筛选建立LLC1-BMT5、PC9-BMT5和H2030-BMT5脑趋向细胞系；对细胞培养上清行iTRAQ定量蛋白组学，并整合人原发与配对脑转移肺癌组织蛋白组学、TCGA/CPTAC及公共单细胞/空间转录组数据；采用RNA-seq、免疫共沉淀-质谱（IP-MS）、免疫荧光和分子对接鉴定sMSLN-TLR4互作；结合ELISA、RT-qPCR、免疫印迹、流式细胞术、Transwell、β-gal染色、ROS与GSH/GSSG检测，以及小鼠心内接种、生物发光成像（BLI）、H&E/免疫组化和中性粒细胞清除及药物干预评价功能。人原发肺癌及配对脑转移组织取自南方医科大学南方医院（Nanfang Hospital of Southern Medical University）。

研究结果：
1. 肺癌中升高的可脱落sMSLN驱动脑转移（Elevated shed sMSLN in lung cancer drives brain metastasis）：研究人员通过iTRAQ比较LLC1-BMT5与亲本细胞培养上清，并交叉人BrM与原发肿瘤蛋白组学，发现MSLN是唯一共同上调的分泌蛋白；ELISA、免疫印迹和RT-qPCR证实脑趋向细胞sMSLN升高；人BrM组织MSLN高于配对原发肿瘤，TCGA显示MSLN高表达与肺腺癌不良预后正相关；sMSLN过表达促进BLI下的BrM和Ki-67⁺（增殖标志）细胞，敲低则抑制BrM并延长生存。结论：肺癌中升高的sMSLN促进BrM进展。

2. sMSLN诱导的TAN富集是BrM形成所需（sMSLN-induced TAN enrichment is required for BrM formation）：CPTAC-LUAD队列中MSLN蛋白水平与中性粒细胞和内皮细胞富集正相关；sMSLN过表达增加CD11b⁺Ly6G⁺中性粒细胞、CD8⁺ T细胞和CD31⁺内皮细胞，MSLN敲低减少TAN和CD31⁺细胞；24 h Transwell显示sMSLN增强中性粒细胞富集，但8 h趋化实验无显著差异，提示其富集主要依赖存活而非趋化；α-Ly6G清除中性粒细胞可逆转sMSLN促BrM和血管生成，DC101联合α-Ly6G无额外获益；人BrM中TAN与MSLN正相关且高于配对原发，空间转录组显示MSLN与TAN及血管内皮细胞空间相关。结论：sMSLN通过TAN富集和血管生成驱动BrM。

3. sMSLN抑制中性粒细胞凋亡以延长其寿命（sMSLN inhibits neutrophil apoptosis to prolong its lifespan）：重组sMSLN（rMSLN）处理骨髓中性粒细胞（BMN）后RNA-seq和GSEA显示凋亡负调控通路富集，抗凋亡基因诱导而促凋亡基因受抑；sMSLN表达细胞条件培养基（CM）抑制活化效应caspase；FACS显示rMSLN和LLC1-BMT5 CM提高中性粒细胞存活、减少凋亡，MSLN敲低CM则降低存活并诱导凋亡；Giemsa和β-gal⁺染色显示rMSLN抑制中性粒细胞衰老和凋亡形态。结论：sMSLN通过抑制凋亡延长中性粒细胞寿命。

4. TLR4是中性粒细胞上sMSLN特异性受体并激活JAK2-STAT3通路（TLR4 is a sMSLN specific receptor on neutrophils to activate the JAK2-STAT3 pathway）：KEGG和GSEA显示rMSLN处理中性粒细胞后Toll样受体和JAK-STAT通路富集；Flag-sMSLN免疫沉淀-质谱鉴定TLR4为候选互作蛋白，免疫共沉淀、共定位免疫荧光和分子对接（约2.0 ?界面）证实sMSLN与TLR4直接结合；公共单细胞RNA-seq GSE202371显示TLR4优先表达于中性粒细胞，小鼠BrM中MSLN与TLR4在中性粒细胞共定位；rMSLN剂量依赖激活JAK2-STAT3，TLR4抑制剂TLR4-IN-C34几乎完全逆转，TLR4-IN-C34或Stattic逆转sMSLN抗凋亡、抗衰老和促存活效应。结论：sMSLN特异性结合中性粒细胞TLR4并激活JAK2-STAT3。

5. sMSLN触发的TLR4-STAT3信号促进溶酶体生物发生、降低细胞ROS并延长中性粒细胞存活（sMSLN-triggered TLR4-STAT3 signaling boosts lysosomal biogenesis, reduces cellular ROS, and extends neutrophil survival）：KEGG和GSEA显示溶酶体通路富集，rMSLN上调溶酶体生物发生和功能相关基因，TLR4或JAK2-STAT3抑制可逆转；MSLN敲低CM降低LAMP1（溶酶体相关膜蛋白1）染色和LysoTracker酸性化，rMSLN则增强且被TLR4-IN-C34或Stattic逆转；rMSLN降低细胞内ROS并提高GSH/GSSG（还原型/氧化型谷胱甘肽比值），抑制剂逆转；Rosup预处理后rMSLN恢复中性粒细胞存活，GSH-EE清除ROS可挽救MSLN敲低CM抑制的存活，Baf-A1抑制溶酶体功能则取消rMSLN促存活。结论：sMSLN经TLR4-STAT3促进溶酶体生物发生和ROS清除以延长中性粒细胞存活。

6. TAN中sMSLN诱导的TLR4-STAT3通路激活驱动BrM（sMSLN-induced activation of the TLR4-STAT3 pathway in TANs drives BrM）：小鼠心内接种sMSLN表达LLC1后，TLR4-IN-C34或Stattic显著抑制sMSLN诱导的BrM形成、大小转移灶数量、长寿命SiglecF⁺Ly6G⁺中性粒细胞和Ly6G⁺细胞积累；TLR4抑制延长生存，额外α-Ly6G清除无叠加效应。结论：sMSLN通过TAN中TLR4-STAT3通路激活促进中性粒细胞长寿并驱动BrM。

7. 联合靶向MSLN和TLR4协同抑制BrM进展（Combined targeting of MSLN and TLR4 synergistically inhibits BrM progression）：在PC9-BMT5和H2030-BMT5 BrM模型中，Anetumab或TLR4-IN-C34单药均抑制BrM并延长生存；联合几乎消除BrM并大幅延长生存，H2030-BMT5模型联合组中位生存82.5天（对照20天），PC9-BMT5模型90天（对照20.5天）；联合进一步减少中性粒细胞和CD31⁺细胞。结论：联合靶向MSLN和TLR4协同抑制肺癌BrM。

讨论与结论：研究人员总结TAN富集调控脑TME并促进恶性适应；中性粒细胞生理寿命短，但TME信号可延长其存活至约4倍，溶酶体功能增强可通过脂代谢和下游信号清除ROS、减少氧化应激诱导的凋亡，而溶酶体功能受损则加重ROS并加速死亡。该研究将sMSLN鉴定为中性粒细胞TLR4的新配体，激活JAK2-STAT3以增强溶酶体生物发生/功能、降低ROS并抑制凋亡；这与既往TLR4激活促进中性粒细胞ROS产生的报道不同，提示TLR4在中性粒细胞中的作用由组织微环境和上游配体共同决定。TLR4具有促肿瘤潜能并支持预转移龛形成，该研究显示BrM龛中TLR4优先表达于中性粒细胞，sMSLN-TLR4轴维持中性粒细胞存活和血管生成。局限性包括：缺乏sMSLN特异性抗体，无法在原发和转移灶中区分sMSLN与膜结合型MSLN（mbMSLN）的组织表达；MSLN沉默实验无法区分sMSLN与mbMSLN的功能；血清sMSLN作为BrM诊断标志物的临床效用仍需前瞻性验证。

研究结论翻译：总之，研究人员的发现表明，肿瘤细胞来源的可脱落sMSLN激活TLR4/STAT3通路以诱导溶酶体生物发生，进而延长中性粒细胞寿命并促进BrM进展，支持靶向sMSLN-TLR4轴是治疗脑转移肿瘤的有前景策略。