《Cell Reports》：CCN1-mediated stress signaling underlies intrinsic cardiomyocyte dysfunction in spinal muscular atrophy
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脊髓性肌萎缩症（SMA）的心脏受累日益被认识，但其细胞基础仍不明确。研究人员利用患者特异性诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSC-CMs）和工程化心脏组织（EHTs），发现SMA中运动神经元生存蛋白（SMN）表达降低、线粒体呼吸缺陷及收缩功能受损。转录组分析显示
脊髓性肌萎缩症（SMA）的心脏受累日益被认识，但其细胞基础仍不明确。研究人员利用患者特异性诱导多能干细胞来源心肌细胞（iPSC-CMs）和工程化心脏组织（EHTs），发现SMA中运动神经元生存蛋白（SMN）表达降低、线粒体呼吸缺陷及收缩功能受损。转录组分析显示，细胞通讯网络因子1（CCN1）是SMA iPSC-CMs中上调最显著的基因之一，这与CCN1在多种心肌病心肌细胞中富集相一致。外源性CCN1加重SMA iPSC-CMs的收缩功能障碍。蛋白质组分析显示p38/丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号持续激活，并被CCN1与肿瘤坏死因子α（TNFα）协同放大，从而将应激信号与SMA心脏功能障碍相联系。丹参酮IIA（tanshinone IIA）治疗可抑制CCN1表达、减弱p38活化并改善收缩功能。值得注意的是，丹参酮IIA与利司扑兰（risdiplam）联合应用在线粒体和收缩性能方面产生叠加获益。总之，这些发现确定了CCN1介导的SMA心脏功能障碍机制，并支持整合依赖SMN与非依赖SMN疗法的联合策略。
研究背景与问题：脊髓性肌萎缩症（SMA）是常染色体隐性神经肌肉病，由运动神经元生存基因1（SMN1）功能缺失导致运动神经元生存蛋白（SMN）降低；SMN2因外显子7跳跃仅部分补偿。SMN增强治疗延长了患者生存，但SMA的系统性受累逐渐显现。临床和模型证据提示心脏受累，包括心动过缓、心律失常、传导异常、结构缺陷和心肌病，但心肌细胞是否对SMN缺失存在细胞自主易感性、心脏病理属原发还是继发、SMN靶向治疗对心脏的影响均不清楚。研究人员因此利用患者iPSC-CMs和EHTs研究SMA内在心肌细胞功能障碍及可干预机制。
技术方法概要：研究纳入3例1型SMA患者（Stanford Neuroscience Health Center招募）和3例健康对照，制备iPSC-CMs和三维EHTs；采用视频光学收缩分析、bulk RNA-seq、无标记液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）蛋白质组学、Seahorse线粒体呼吸检测、免疫荧光、免疫印迹、实时定量PCR、CCN1小干扰RNA（siRNA）敲低，以及CCN1、TNFα、丹参酮IIA和利司扑兰（risdiplam）干预；并再分析公共扩张型心肌病（DCM）、肥厚型心肌病（HCM）、缺血性心肌病（ICM）bulk RNA-seq与单核RNA-seq数据集（GSE116025、GSE46224、GSE130036及Hill等、Chaffin等数据）。
研究结果：1. 1型SMA患者来源人iPSC-CMs重现收缩功能障碍。TNNT2免疫染色确认心肌分化；SMA iPSC-CMs的SMN蛋白降低、细胞尺寸和肌节密度降低而核大小不变；2D收缩和舒张速度及自发搏动率降低，3D EHTs收缩力、收缩和舒张速度降低，提示不依赖神经元输入的细胞自主功能障碍。2. SMA iPSC-CMs转录组分析显示细胞应激和CCN1介导的收缩功能障碍。RNA-seq发现390个上调、304个下调基因，SMN1转录降低且SMA缺失外显子7；GO富集于细胞外区域、细胞通讯、刺激反应、程序性死亡和凋亡，CCN1显著上调并经qPCR、免疫印迹、免疫荧光和EHT验证；CCN1敲低部分挽救收缩，重组CCN1降低健康细胞收缩并加重SMA细胞缺陷。3. CCN1在心脏疾病背景下于心肌细胞中特异性上调。再分析DCM、HCM、ICM患者心脏转录组显示CCN1升高，STRING网络提示其互作蛋白在病心中高表达；单核RNA-seq显示正常心CCN1较高见于脂肪细胞和成纤维细胞，而病心心肌细胞CCN1及其互作伙伴升高，提示心肌细胞中心性反馈。4. 蛋白质组学揭示SMA iPSC-CMs线粒体功能异常。无标记蛋白质组学发现40个下调、50个上调蛋白，下调蛋白富集于线粒体膜、呼吸链组装、线粒体基因表达和嵴形成，IMMT、SAMM50、ATP5PO降低；MitoTracker Green和TMRE显示线粒体含量和膜电位降低，Seahorse显示基础/最大耗氧率（OCR）和ATP产生降低；MitoQ仅部分挽救收缩。5. 蛋白质组学发现SMA iPSC-CMs中持续性p38/MAPK活化。上调蛋白富集RNA代谢和剪接体，提示代偿；亦富集MAPK靶点和MAPK介导核事件，包括MAPK14、PPP2R1A、RPS6KA3；免疫荧光和免疫印迹证实p38磷酸化升高，EHT中亦升高，提示持续p38/MAPK活化可能是效应器。6. CCN1放大TNFα诱导的HC iPSC-CMs p38活化和收缩损伤。TNFα与重组CCN1共处理较TNFα单处理协同增加磷酸化p38，并在2D和3D EHT中进一步降低收缩和舒张速度及收缩力。7. 丹参酮IIA抑制SMA iPSC-CMs中CCN1表达、p38磷酸化和ROS。丹参酮IIA降低CCN1 mRNA和蛋白，降低磷酸化p38而总p38不变，并部分降低活性氧（ROS）。8. 利司扑兰与丹参酮IIA联合治疗改善SMA iPSC-CMs线粒体和收缩功能。在TNFα刺激下，利司扑兰单药改善收缩优于丹参酮IIA，联合治疗进一步增加2D收缩/舒张速度和EHT收缩力；EHT中利司扑兰升高SMN而丹参酮IIA不升高，联合更有效抑制CCN1和p38磷酸化；Seahorse显示联合改善基础/最大OCR、ATP产生和备用呼吸容量。
讨论与结论：讨论指出，SMA长期被视为运动神经元病，但临床证据支持心脏受累；该研究用iPSC-CMs验证细胞自主表型，揭示细胞外基质蛋白CCN1通过异常p38/MAPK信号参与心脏功能障碍，并将该应激轴从运动神经元和骨骼肌扩展至心脏。线粒体功能障碍与收缩障碍相关，改善线粒体仅部分挽救，提示多因素机制。丹参酮IIA抑制CCN1/p38并改善收缩，与利司扑兰联合改善收缩和线粒体功能，支持同时靶向SMN依赖与非依赖通路。局限性包括iPSC-CMs线间转录组变异、模型缺乏成纤维细胞和免疫细胞、CCN1未被质谱检出、需长期动物研究、未证明丹参酮IIA直接靶向CCN1或p38/MAPK、丹参酮IIA药代动力学不利及p38通路复杂。研究结论翻译：总之，这些结果为一种联合治疗策略提供了证据，该策略可改善SMA iPSC-CMs中的细胞应激，并与p38/MAPK信号、线粒体功能和收缩功能相关；这种整合方法有望在SMA患者中实现更全面和持久的心脏功能障碍挽救，并可能获得超越单纯SMN恢复所能达到的临床结局。
