APOBEC3脱氨酶在肺腺癌中突变作用的异质性研究：从单碱基替换到插入缺失突变的遗传学解析

《Cell Reports》：Heterogeneous contributions of APOBEC3 deaminases to substitution and indel mutagenesis in lung adenocarcinoma

　　

APOBEC3胞嘧啶脱氨酶是癌症突变的主要来源之一。在肺腺癌（LUAD）中，APOBEC3活性驱动肿瘤演化与治疗耐药，使这些酶成为治疗靶点。尽管APOBEC3A驱动了大多数癌症中APOBEC3相关突变特征负荷，但各旁系同源物在LUAD中的相对贡献仍不清楚。本研究利用CRISPR-Cas9敲除以及对197个长期传代单细胞克隆的全基因组测序，明确了内源性失调的APOBEC3脱氨酶的作用。APOBEC3突变发生可分为三种模式，分别主要由APOBEC3A驱动、由APOBEC3A和APOBEC3B共同驱动，或尽管可检测到酶表达但突变水平极低。常用的替代指标，包括mRNA和蛋白水平以及体外脱氨酶活性，均无法预测这些贡献。研究人员还提供了首个因果证据，证明内源性APOBEC3A可产生插入缺失突变特征InD9a，并将其与胞嘧啶脱氨后的尿嘧啶切除相关联。这些异质性贡献凸显了开发能够区分单个APOBEC3活性的生物标志物的必要性，以指导治疗靶向。

**研究背景与存在问题**

APOBEC3胞嘧啶脱氨酶是癌症基因组中单碱基替换（SBS）突变的重要来源，可在超过70%的癌症类型中产生SBS2和SBS13（SBS2/13）突变特征，其特征为TC二核苷酸处的C>T和C>G/C>A突变。在膀胱癌中，高APOBEC3突变负荷与部分患者生存期改善相关；而在激素受体阳性乳腺癌中，APOBEC3特征富集于治疗后肿瘤，并与较短的无进展生存期及治疗耐药相关。在肺腺癌（LUAD）中，APOBEC3突变特征尤为突出，存在于超过50%的肿瘤中，且多项独立证据表明APOBEC3活性参与LUAD演化与治疗耐药。然而，各APOBEC3旁系同源酶在LUAD突变发生中的相对贡献仍不完全清楚。APOBEC3A与APOBEC3B被认为是癌症中APOBEC3相关突变的主要来源，但二者在不同癌症类型及不同肿瘤间的贡献比例存在争议。LUAD患者的SBS2/13突变在RTCA与YTCA序列上下文富集方面表现出显著的肿瘤间异质性，提示APOBEC3B在此恶性肿瘤中可能具有独特或更重要的作用。一个关键未解问题是：独立于治疗产生的内源性APOBEC3A和APOBEC3B失调是否以及以何种相对比例参与LUAD突变发生。回答这一问题对于合理设计治疗靶向策略至关重要。

**研究内容与结论**

研究人员将CRISPR-Cas9介导的APOBEC3A和APOBEC3B基因敲除与谱系解析的全基因组测序（WGS）相结合，首次在LUAD中明确将未经治疗细胞中产生的APOBEC3相关突变特征归属于其酶学来源。研究发现，内源性失调的APOBEC3A和APOBEC3B对SBS2/13的贡献具有高度异质性，可归纳为三种模式：主要由APOBEC3A驱动、由APOBEC3A和APOBEC3B共同驱动、或尽管可检测到酶表达但突变极少。研究还提供了首个因果证据，证明内源性APOBEC3A产生插入缺失突变特征InD9a，并将其与胞嘧啶脱氨后的尿嘧啶切除（由UNG2介导）相关联。此外，常用的替代指标——包括mRNA和蛋白水平、体外脱氨酶活性以及RNA编辑活性——均无法可靠预测单个APOBEC3酶的实际突变贡献，凸显了开发能够区分各酶活性的生物标志物的必要性。

**主要关键技术方法**

研究人员利用CRISPR-Cas9技术构建了APOBEC3A和APOBEC3B单敲除及双敲除（dKO）的LUAD细胞系模型（包括NCI-H2347、PC9和NCI-H1650），并采用谱系解析的全基因组测序（WGS）策略，对野生型（WT）和敲除（KO）单细胞来源的多个亚克隆进行长期传代培养（NCI-H2347和NCI-H1650超过150天，PC9达389天），随后对亲本及子代克隆进行30×WGS测序，以鉴定新发突变并提取突变特征。研究还使用了免疫印迹、qPCR、体外DNA胞嘧啶脱氨酶活性测定、DDOST C558 RNA编辑活性检测、以及SigProfiler等生物信息学工具进行突变特征提取与序列上下文富集分析。样本来源包括NCI-H2347、NCI-H1650、PC9 LUAD细胞系，以及既往研究中的乳腺癌（BT-474、MDA-MB-453）和淋巴瘤（BC-1、JSC-1）细胞系。

**研究结果**

**LUAD细胞系重现患者肿瘤中异质性的APOBEC3突变序列上下文**

通过对1,686例泛癌全基因组数据的分析，研究人员确认LUAD患者肿瘤在YTCA/RTCA富集比率上表现出显著异质性，明显区别于头颈癌和膀胱癌中较为统一的YTCA富集模式。对64个LUAD细胞系的全外显子组数据进行分析，发现这些细胞系同样呈现类似的异质性。研究人员从中选出三个代表性细胞系：NCI-H2347（SBS2/13显著富集于APOBEC3A偏好的YTCA上下文）、PC9（突变偏向APOBEC3B偏好的RTCA上下文但无可检测的SBS2/13）、以及NCI-H1650（YTCA和RTCA均无显著富集）。对这三个细胞系进行蛋白、mRNA和酶活性检测后发现，NCI-H2347在各检测中表现为高APOBEC3A蛋白、高DNA脱氨酶活性和高RNA编辑活性，而PC9和NCI-H1650则呈现检测结果之间的不一致性，表明常用的替代检测方法可能无法真实反映APOBEC3的致突变活性。

**单细胞来源的LUAD谱系揭示遮蔽替代活性检测的亚克隆APOBEC3表达**

研究人员从三个细胞系中分别建立了单细胞来源的野生型亚克隆谱系。免疫印迹分析显示，APOBEC3A蛋白在NCI-H1650谱系中一致不可检测，在NCI-H2347谱系中一致高表达，而在PC9谱系中表现出显著的亚克隆异质性——尽管PC9亲本群体中APOBEC3A蛋白水平较低，但部分单个细胞来源的亚克隆表达显著升高，表明高表达亚群在群体水平测量中被低估。APOBEC3B蛋白在各细胞系的不同亚克隆间相对均匀。qPCR分析显示mRNA水平与蛋白水平相关性差，提示转录后调控可能是APOBEC3蛋白丰度的主要决定因素。脱氨酶活性测定和DDOST RNA编辑活性检测均未显示与蛋白水平一致的梯度变化，进一步表明群体水平的测量无法解析肿瘤细胞群体中哪些APOBEC3酶具有致突变活性。

**遗传学解析内源性APOBEC3A和APOBEC3B对LUAD全基因组突变的贡献**

研究人员利用CRISPR-Cas9在三个LUAD细胞系中分别敲除APOBEC3A、APOBEC3B或两者，并通过长期传代后的谱系WGS分析新发突变。在NCI-H2347中，WT谱系积累了高水平的de novo SBS2/13突变，APOBEC3A敲除后SBS2/13负荷显著降低（p < 0.0001），而APOBEC3B敲除无显著影响，证实APOBEC3A是该细胞系中突变发生的主要驱动者。在PC9中，尽管群体水平无检测到的SBS2/13，但WT谱系在389天内积累了大量的de novo SBS2/13。单个敲除APOBEC3A或APOBEC3B均未显著降低SBS2/13负荷，但双敲除完全消除了SBS2/13的获得（p < 0.0001），且序列上下文分析表明APOBEC3A敲除后残留突变富集于RTCA、APOBEC3B敲除后残留突变富集于YTCA，证明两个酶在该细胞系中具有相当的致突变活性。在NCI-H1650中，WT子代克隆在传代期间基本未获得SBS2/13突变（仅一个克隆例外，该克隆的突变富集于YTCA上下文），表明APOBEC3A突变爆发在该细胞系中可能为罕见事件。此外，PC9谱系中一致观察到SBS3（同源重组缺陷相关特征）和InD6的贡献，这是该常用细胞系中首次发现HR缺陷相关特征。

**APOBEC3A和APOBEC3B对LUAD成簇突变的贡献**

研究人员分析了各基因型谱系中de novo omikli（中等密度簇）和kataegis（高密度簇）事件的发生。在NCI-H2347中，APOBEC3A敲除显著减少了omikli（p = 0.019）和kataegis（p = 0.037）的获得，而APOBEC3B敲除无显著效应，与散在SBS2/13的结果一致。在PC9中，APOBEC3B敲除显著降低了成簇突变（omikli p < 0.001，kataegis p < 0.05），双敲除也有显著降低（omikli p < 0.0001，kataegis p < 0.05），APOBEC3A敲除则显示kataegis减少的趋势。NCI-H1650中成簇事件极少，敲除无显著影响。这些结果表明APOBEC3A和APOBEC3B的上下文依赖性层级同样适用于成簇超突变过程。

**APOBEC3脱氨酶驱动InD9a插入缺失突变特征**

研究人员从本研究的LUAD细胞系及既往的乳腺癌和淋巴瘤细胞系数据中联合提取插入缺失突变特征，鉴定出可分解为肿瘤来源特征（包括InD9a）的“CH89B”特征。在NCI-H2347和MDA-MB-453中，APOBEC3A敲除显著降低InD9a获得（均p < 0.01）；在PC9和MDA-MB-453中，APOBEC3A/APOBEC3B双敲除显著降低InD9a（分别p < 0.05和p < 0.01）。APOBEC3B敲除在所有细胞系中均无显著效应。UNG2敲除的MDA-MB-453克隆显示InD9a负荷降低的趋势（p = 0.057）。相关性分析显示，de novo InD9a负荷与SBS13负荷强相关（R² = 0.72，p < 2.2e?16），而与SBS2相关性较弱（R² = 0.42，p = 2.8e?11），支持InD9a与SBS13共享同一脱嘌呤/脱嘧啶（abasic）位点依赖的加工通路。这些数据首次为内源性APOBEC3A在人癌细胞中驱动InD9a产生提供了因果证据。

**讨论与结论**

本研究建立了一个实验框架，用于解读在YTCA/RTCA富集模式高度异质性的癌症类型中APOBEC3旁系同源酶的突变贡献。在YTCA富集的NCI-H2347模型中，APOBEC3A是突变发生的主要驱动者，APOBEC3B尽管有表达但无可检测贡献；在RTCA偏好的PC9中，APOBEC3A和APOBEC3B均活跃并共同贡献突变负荷；而在突变特征极低的NCI-H1650中，可能存在罕见的、影响少数克隆的阵发性APOBEC3A活性。关键发现是标准替代检测方法（蛋白免疫印迹、体外脱氨酶活性、mRNA定量和RNA编辑检测）均无法可靠预测APOBEC3的致突变活性，这解释了该领域长期存在的不确定性。亚克隆水平的APOBEC3A表达异质性使群体测量结果具有误导性。研究还通过遗传学手段证实InD9a由APOBEC3A驱动，其与SBS13的强相关性支持两者源于相同的脱碱基位点加工通路。本研究界定的酶特异性层级适用于从散在替换和插入缺失到成簇omikli和kataegis的全谱系APOBEC3相关突变类型，并强调了APOBEC3突变的本质上是阵发性的这一特征。研究结论指出，准确预测治疗脆弱性需要直接评估酶特异性活性，而非依赖历史突变模式或常用替代指标；开发能够区分单个APOBEC3活性的生物标志物对于指导APOBEC3抑制剂（目前正在开发中）的治疗靶向至关重要。