单细胞多组学揭示T细胞亚群共享的原型调控程序

《Cell Reports》：Single-cell multi-omics reveals archetypal regulatory programs shared across T cell subsets

　　

T细胞在应对病原体时分化成功能不同的亚群，然而自我更新、扩增、细胞因子产生和细胞毒性等基本免疫功能为多个亚群所共有，因此必须通过共享的调控机制来编程。为揭示这些“原型”表观基因组程序，研究人员将急性与慢性病毒感染中CD4和CD8T细胞应答的单细胞多组学（scATAC+RNA-seq）数据集与一个全面的批量ATAC-seq参考集进行了整合。分析揭示了调控T细胞身份的模块化架构，提示不同转录因子在跨亚群和谱系复用调控程序中发挥作用。值得注意的是，对持续免疫至关重要且在急性和慢性感染中均存在的具有转化意义的前体CD8T细胞，表现出一种复合调控状态，即结合了CD8耗竭程序与滤泡辅助性CD4T细胞程序。总之，该资源及通用计算框架将有助于适应性免疫的机制解析和免疫治疗设计。

论文解读：单细胞多组学揭示T细胞亚群共享的原型调控程序

一、研究背景与科学问题

T细胞在应对病原体时分化出功能各异的亚群，但自我更新、扩增、细胞因子产生和细胞毒性等核心免疫功能并非某一亚群独有，而是跨亚群反复出现，提示这些功能由共享的调控程序驱动。例如，干扰素-γ（IFN-γ）产生既是效应CD8T细胞也是CD4Th1细胞的标志；L-选择素（CD62L）标记初始和中央记忆T细胞；滤泡辅助性CD4T细胞（Tfh）和耗竭CD8T细胞均表达抑制性受体程序性死亡受体1（PD-1）和转录因子TOX；趋化因子受体CXCR5在Tfh和祖细胞耗竭CD8T细胞之间共享。然而，既往研究多依赖有限标志物的流式细胞术，难以无偏比较不同模型中离散和连续的T细胞表型异同。淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）感染模型是研究不同免疫应答的黄金标准系统，但既往基因组学研究多聚焦CD8T细胞，对CD4亚群及其与CD8应答的关系研究不足。此外，急性（Armstrong株）和慢性（Clone 13株）感染常被描述为诱导基本不重叠的T细胞亚群，这一观点有待系统检验。因此，研究人员旨在利用单细胞多组学技术，系统解析T细胞应答中共享与情境特异的调控程序。

二、研究内容与主要结论

研究人员对LCMV Armstrong（急性）或Clone 13（慢性）感染后第7天的小鼠脾脏T细胞进行了单细胞染色质可及性（scATAC-seq）和转录组（scRNA-seq）联合分析，并整合了包含285个批量ATAC-seq谱的T细胞调控元件参考图谱。研究发现，急性与慢性感染中所有主要CD4和CD8T细胞功能状态（包括初始、记忆、效应、调节性、Tfh、耗竭和祖细胞群体）均存在，仅频率不同，表明两种感染模式的免疫学差异本质上是数量性而非质量性的。值得注意的是，前体CD8T细胞在转录组和表观基因组水平上均与CD4Tfh细胞高度相似。通过原型分析（archetypal analysis），研究人员发现前体CD8T细胞并非具有独特调控程序，而是CD8耗竭与CD4Tfh两种原型程序的复合体。转录因子（TF）基序分析和等位基因特异性分析进一步支持了这一结论，提示Nfat、Lef1/Tcf1、AP-1等因子在调控前体CD8T细胞身份中发挥关键作用。此外，研究还发现Tfh原型程序在前体CD8T细胞和CD4Tfh细胞内部均呈现连续的分化梯度，且Clone 13感染加速了这一梯度的进展。

三、关键技术方法

本研究采用的主要技术方法包括：单细胞多组学测序（scATAC+RNA-seq）同步捕获染色质可及性和基因表达；整合17项已发表研究的285个批量ATAC-seq谱构建T细胞染色质可及性参考图谱；利用原型分析对染色质可及性谱进行低秩矩阵分解，识别极端状态（原型）；基于TF基序扫描和评分关联TF活性与调控程序；利用B6×Cast F1杂交小鼠的自然遗传多态性进行等位基因特异性分析，直接测量基序变异对局部染色质可及性的功能影响；并对已发表的Daniel等和Giles等数据集进行统一重分析验证。

四、研究结果

（1）ATAC-seq参考集实现对LCMV感染T细胞scATAC+RNA-seq数据的稳健分析

研究人员构建了包含223,492个峰的T细胞染色质可及性参考图谱，并开发了整合该图谱的计算框架。基于scATAC-seq数据，研究人员识别出所有主要CD4和CD8T细胞功能状态，包括初始、记忆、效应、Treg、Tfh、耗竭和祖细胞群体。所有亚群在Armstrong和Clone 13感染中均可重复检出，仅频率不同。值得注意的是，急性Armstrong应答中也存在耗竭样CD8T细胞，挑战了耗竭仅限于慢性感染或癌症的传统观点。此外，研究还发现标准scATAC-seq和scRNA-seq分析流程可能将具有不同身份的细胞群体错误聚类，而基于染色质可及性的分析能更稳定地反映细胞身份。

（2）早期LCMV Armstrong和Clone 13应答中共享的前体CD8T细胞状态

研究证实前体CD8T细胞群体在急性和慢性感染中均存在，并富集Cxcr5、Slamf6、Tox、Tcf7、Id3和Il7r等前体相关基因。通过统一重分析Daniel等和Giles等的已发表scATAC-seq数据集，研究人员发现先前被注释为慢性感染特异性“前体耗竭”和急性感染特异性“记忆前体效应细胞”的两群细胞，实为同一潜在状态，支持前体CD8T细胞在急性与慢性应答早期共存的结论。

（3）前体CD8T细胞与滤泡辅助性CD4T细胞具有相似的染色质可及性和基因表达谱

全基因组水平的比较显示，抗原激活状态比谱系身份更能决定表观基因组和表型的相似性。前体CD8T细胞与CD4Tfh细胞在染色质可及性和转录组谱上最为相似，两者共享Cxcr5、Bcl6、Tox、Pdcd1、Pou2f2、Tcf7和Icos等关键标志基因的活性。

（4）scATAC-seq原型分析揭示前体CD8T细胞的混合调控程序

应用k=8的原型分析，研究人员识别出对应特定细胞状态或共享功能程序的调控原型。前体CD8T细胞缺乏主导原型，而是主要表现出CD8耗竭和CD4Tfh原型的混合特征。对单个基因座的分析显示，同一基因（如Tox）的不同调控元件可归属于不同原型，并在不同细胞类型中差异关联基因表达，支持前体CD8T细胞整合Tfh和耗竭CD8T细胞调控特征的观点。

（5）TF基序分析揭示原型程序和前体CD8T细胞身份的调控驱动因子

基序富集分析显示，前体CD8T细胞富集的TF基序组合了与CD4Tfh原型最相关的Nfat、Lef1/Tcf1、Pou2f1/2基序和与CD8耗竭原型最相关的Runx和Tbet基序。等位基因特异性分析进一步验证了这些基序的功能参与：AP-1基序在所有抗原激活群体中均有显著信号；Lef1/Tcf7基序在初始、记忆、Tfh和前体细胞中显著；Nfat基序则在前体CD8、Th1和Tfh群体中表现出选择性功能关联。

（6）Tfh原型捕获Tfh细胞和前体CD8T细胞内部相似的分化梯度

在CD4Tfh群体内部，Tfh原型权重呈连续梯度，与Tox、Pdcd1、Bcl6、Icos等激活相关基因正相关，与Sell、Il7r等静息相关基因负相关。前体CD8T细胞内部同样存在类似的Tfh原型连续梯度，且众多基因与Tfh原型的相关性在两个群体中高度一致。Tfh原型与CD8耗竭原型在多个细胞群体内均不相关，表明两者捕获基本不重叠的调控程序。

（7）Clone 13感染加速CD4Tfh和前体CD8T细胞沿Tfh分化梯度的进展

在前体CD8T细胞群体中，Clone 13感染的Tfh和CD8耗竭原型权重显著高于Armstrong，而CD8初始原型在Armstrong中更高。两种感染中均存在相似的Tfh分化梯度，但Clone 13细胞沿该梯度进展更快。TF基序分析显示，AP-1、Tbet和Nfat等激活相关基序在Clone 13中信号更强，而Lef1/Tcf7和Ets等初始/记忆样基序在Armstrong中更富集。

五、讨论与结论

本研究表明，急性与慢性病毒应答的免疫学差异本质上是数量性的，由相似细胞状态相对丰度的变化驱动，而非应答特异性细胞身份的出现。前体CD8T细胞作为CD8耗竭和Tfh原型的复合体，支持了前体身份的模块化观点——通过复用其他T细胞状态中已部署的调控程序，实现自我更新和抵抗终末耗竭。这种“分子对冲”可能赋予前体细胞生存优势。研究还提示前体CD8T细胞与Tfh细胞可能存在功能性和空间性联系，未来需通过空间转录组学、细胞间相互作用测量和扰动实验进一步阐明。该研究提供了可推广的计算框架，适用于肿瘤浸润淋巴细胞、疫苗应答和自身免疫病等其他T细胞情境。研究局限性包括仅分析第7天单时间点、存在少量谱系标记混合细胞以及发现仍属关联性而非因果性。结论部分指出，该多组学和计算方法有助于解析复杂T细胞调控，为研究跨免疫情境的共享与特异程序提供了通用框架。