微生物接种剂对甜瓜伸蔓期根际土壤养分、细菌群落结构及功能潜力的影响

《Life》：Effect of Microbial Inoculants on Rhizosphere Soil Microbial Community Structure in Melon

　　

甜瓜（Cucumis melo L.）根际微生物群落在土壤养分转化和植株生长中具有重要作用。施用微生物接种剂是调控根际微生态和提高土壤养分有效性的有效途径。本研究在甜瓜伸蔓期施用Bacillus altitudinis和Rhodopseudomonas palustris，采用土壤理化分析和基于DNBSEQ-T7测序平台的根际土壤微生物宏基因组测序，探究微生物接种剂对土壤养分、细菌群落多样性及群落结构的影响。结果表明，施用微生物接种剂有效改变了土壤理化性质，并影响根际细菌多样性和群落结构，但未显著改变优势细菌门的总体组成。冗余分析（RDA）表明，施用微生物接种剂后，细菌群落结构与速效钾（AK）和NO₃^?-N呈正相关，与Cl^?呈负相关。宏基因组分析显示，本研究所用微生物接种剂未显著改变微生物群落的总体功能结构，仅显示出调节特定功能的潜力。总之，本研究为通过施用微生物接种剂改善甜瓜根际土壤理化性质、调控根际微生物群落结构提供了理论依据。

研究背景与问题：甜瓜（Cucumis melo L.）是重要园艺作物，具有较高营养和商品价值，其品质除受品种遗传特性调控外，还与土壤环境条件和根际微生物生态过程密切相关。甜瓜根际微生物与生育阶段紧密相关，伸蔓期茎、叶和根快速发育，土壤养分需求增加，根际微生物可通过多途径参与氮（N）、磷（P）、钾（K）等养分转化，提高土壤养分有效性和植株养分获取能力。因此，伸蔓期根际土壤微生物群落是连接土壤养分转化与甜瓜营养生长的重要生物学环节。长期大量施用化肥可导致土壤酸化、养分失衡、有机质下降，并引起土壤微生物多样性降低和群落结构简化，削弱土壤生态系统稳定性和养分循环功能。微生物接种剂兼具养分供给和微生物调节功能，Bacillus altitudinis可增强植物抗逆性、提高养分利用效率，Rhodopseudomonas palustris具有多种代谢能力，可参与有机物降解、碳转化、固氮、养分活化和植物激素调节。不同功能微生物组合可能通过功能互补增强调控效应，但其对特定作物关键生育期根际微生物群落的作用机制尚待阐明。以往温室甜瓜研究多关注土壤肥力、病害防控及产量品质，对伸蔓期根际微生物群落结构、多样性和功能潜力的响应研究有限。基于此，研究人员在常规施肥基础上施用单菌及混合微生物接种剂，结合土壤理化性质分析和宏基因组测序，探究其对甜瓜根际土壤微生物群落结构和功能特征的影响，以期为温室甜瓜微生物肥料科学施用提供理论依据和数据支持。

关键技术方法（≤250字）：试验位于中国山东省青岛市莱西市马连庄镇（37°00′–37°09′ N，120°21′–120°33′ E），暖温带半湿润季风气候，砂壤土；以塑料大棚“日本甜宝”甜瓜为对象，伸蔓初期根区施用VT1（Bacillus altitudinis）、VT2（Rhodopseudomonas palustris）、VT3（两者1:1混合）及Vck（无菌水），每处理3个小区。伸蔓后期按S形采样采集根际土，部分于?80 ℃保存用于DNBSEQ-T7宏基因组测序，部分风干测定pH、AK、速效磷（AP）、有机质（OM）、铵态氮（NH₄⁺-N）、NO₃^?-N和Cl^?。测序数据经质控、组装、ORF预测、非冗余基因集构建，并基于NR、COG（直系同源簇）、KEGG（京都基因与基因组百科全书）和CAZy（碳水化合物活性酶）数据库注释，结合α多样性、主坐标分析（PCoA）、RDA及相关分析。

研究结果：3.1 微生物接种剂对根际土壤理化性质的影响：通过土壤理化分析发现，各处理pH和OM无显著差异；VT1、VT2和VT3均显著提高AK，VT1最高，达179.91 ± 2.85 mg kg^?1，较Vck增加30.65%，VT3与VT1无显著差异，VT2显著高于Vck但低于VT1和VT3；AP仅VT2和VT3显著高于Vck和VT1；VT1显著提高NH₄⁺-N至15.28 ± 0.41 mg kg^?1，较Vck增加14.97%；三种接种处理均显著提高NO₃^?-N，VT2最高，达91.35 ± 5.80 mg kg^?1，较Vck增加43.88%，VT3和VT1分别增加43.06%和27.82%；三种处理均显著降低Cl^?，VT1、VT2和VT3分别较Vck降低35.41%、23.74%和23.81%。结论为微生物接种剂可改变根际土壤养分有效性，且不同菌剂效果存在差异。

3.2.1 土壤细菌群落组成分析：通过DNBSEQ-T7宏基因组测序获得842 million high-quality Clean Reads，每样本66.2–73.6 million，组装获得6,693,385个contigs，N50为965.67–991.00 bp。α多样性分析显示，VT2的Sobs和ACE指数显著高于VT1，其余与Vck或VT3无显著差异，Chao指数无显著差异；VT1、VT2和VT3的Shannon指数均显著高于Vck，VT2最高（6.34 ± 0.01），Simpson指数无显著差异。属水平Venn分析显示，四处理共有6364个属，占91.29%，Vck、VT1、VT2和VT3分别有71、25、34和40个独特属。门水平上，Pseudomonadota、Actinomycetota、Bacteroidota、Gemmatimonadota、Chloroflexota、Acidobacteriota、Myxococcota、Planctomycetota、Verrucomicrobiota和Bacillota合计约占85%，其中Pseudomonadota占36–40%，Actinomycetota占18–20%，总体组成较稳定。PCoA显示处理间细菌群落结构显著分离（R = 0.722，p = 0.001），Vck主要分布于PC2正向，VT1和VT2主要聚集于PC2负向。结论为接种剂对细菌丰富度影响有限，但可提高多样性并塑造群落结构，未显著改变优势门总体组成。

3.2.2 环境因子与微生物群落互作：通过RDA和相关分析，RDA1和RDA2分别解释27.91%和14.02%的细菌群落结构变异；AK（R² = 0.5539，p = 0.027）、NO₃^?-N（R² = 0.8430，p = 0.001）和Cl^?（R² = 0.6055，p = 0.015）与群落结构显著相关；Vck与Cl^?正相关，VT1、VT2和VT3与Cl^?负相关、与AK和NO₃^?-N正相关。50个最丰富属与理化性质相关分析显示，Luteitalea、Candidatus_Udaeobacter、Nitrospira、Candidatus_Defluviilinea和Candidatus_Villigracilis与AK显著正相关（p < 0.01），Haliangium、Ramlibacter和Chryseosolibacter与AK显著负相关（p < 0.01）；Nitrososphaera与NO₃^?-N显著正相关（p < 0.05），Candidatus_Gaiellasilicea与NO₃^?-N显著负相关（p < 0.05）。结论为微生物群落与土壤养分状态存在密切生态耦合。

3.3.1 COG功能注释：通过COG功能注释统计，氨基酸转运与代谢（E）read丰度最高，为411,196，能量产生与转换（C）为331,101；碳水化合物转运与代谢（G）、细胞壁/膜/包膜生物发生（M）、信号转导机制（T）和无机离子转运与代谢（P）丰度较高；一般功能预测或功能未知合计125,231。四组COG功能组成高度相似，主要功能类别无明显波动。结论为处理未显著扰动微生物群落总体功能结构。

3.3.2 KEGG功能分析：通过KEGG Level 2注释，碳水化合物代谢和氨基酸代谢相对丰度最高；VT3中碳水化合物代谢、氨基酸代谢和能量代谢相关基因丰度高于Vck，异生物质降解与代谢及萜类和聚酮代谢呈增加趋势，但原文指出这些基因丰度变化缺乏统计显著性，仅作为趋势推断。LEfSe分析鉴定11个LDA score > 2.0的候选KO（KEGG Orthology）：VT1中K12132、K21449和K02482为候选特征，K12132（prkC）LDA score最高，编码参与蛋白磷酸化和环境信号响应的Hanks型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；VT2中候选特征包括转座酶和TRAP型转运蛋白相关KO；VT3中K01992和K07114为候选特征，K01992编码ABC-2型转运蛋白透性酶，K07114注释为Ca²⁺激活氯通道同源物。结论为不同接种剂处理相关功能潜力存在差异，涉及信号转导与生理调节、遗传移动与底物转运、跨膜转运与离子调节。

3.3.3 CAZy碳水化合物分析：通过CAZy注释，鉴定出糖苷水解酶（GH）、糖基转移酶（GT）、碳水化合物酯酶（CE）、碳水化合物结合模块（CBM）、多糖裂解酶（PL）和辅助活性（AA）六大类，共220,007个基因，GH最多，GT次之；GH相对丰度在Vck、VT1、VT2和VT3中分别为36.05%、35.49%、35.72%和35.76%；GT相对丰度以VT3最高（35.92%），Vck、VT1和VT2分别为34.86%、35.43%和35.07%。结论为GH和GT在各处理中占主导，组间差异较小，未诱导碳水化合物利用策略明显转变。

讨论与结论：讨论部分指出，伸蔓期是甜瓜营养生长和根系发育活跃阶段，需充足矿质养分并依赖根–微生物互作；施用接种剂后pH未显著变化，与Martínez et al.的结果一致，并处于甜瓜生长适宜范围，作用主要体现在养分有效性和微生物群落组成调控。AK提高可能与Bacillus altitudinis的解钾能力有关，AP提高可能与Rhodopseudomonas palustris产有机酸和铁载体促进难溶性磷转化有关；NO₃^?-N提高分别与Bacillus altitudinis的氮代谢/氨化作用及Rhodopseudomonas palustris的固氮能力有关。α多样性结果表明接种剂未大幅增加细菌物种数，但改变类群相对丰度分布，使群落结构更均衡；优势细菌类群未显著变化，说明未破坏原有根际细菌群落稳定性，与Quiroga et al.的结果一致；Venn分析中91.29%的共享类群及PCoA分离表明，外源功能微生物未替换优势门，但可改变根际细菌群落总体结构；讨论还指出AK、NO₃^?-N和NH₄⁺-N与细菌群落结构密切相关。功能分析中，COG显示根际微生物群落具有较强物质转化和能量获取潜力，KEGG显示碳水化合物代谢和氨基酸代谢为主要功能类别，混合接种与单菌接种富集的功能基因不完全一致，提示不同接种剂及组合可能通过差异功能选择影响功能组成；CAZy分析中GH和GT相关基因仅有轻微变化，总体功能组成较稳定。原文同时强调，上述分析仅反映微生物群落的基因组成和预测功能潜力，未来需结合转录组、蛋白组、基因表达分析及互补功能实验进一步阐明其生物学意义。

研究结论部分可译为：本研究证明，不同微生物接种剂处理对甜瓜伸蔓期根际土壤养分状态、细菌群落结构和功能潜力具有差异化影响。微生物接种剂不仅调控根际土壤有效养分水平，也改变细菌群落多样性和组成。进一步宏基因组分析揭示，微生物群落对不同接种剂的功能响应存在处理特异性模式。这些结果阐明了微生物接种剂对甜瓜伸蔓期根际土壤养分状态、细菌群落结构和预测功能潜力的影响，并可为甜瓜生产中微生物接种剂的功能筛选和合理配方提供信息。未来研究可设置灭活菌株或未接种培养基对照，以区分接种菌株与其他接种剂成分的效应；还可将菌株存活和功能活性测定与基因表达分析及其他互补功能测定结合，进一步研究实际土壤微生物活性和功能。