健康阿尔及利亚女性阴道乳酸菌分离株的菌株依赖性免疫调节谱及Limosilactobacillus fermentum 70BJ2在多种巨噬细胞模型中的突出调节特征

《Life》：Vaginal Lactic Acid Bacteria Isolated from Healthy Algerian Women Display Distinct Immunomodulatory Profiles Across Macrophage Models

　　

阴道微生物群参与黏膜免疫稳态，但单个阴道乳酸菌（LAB）菌株的免疫调节特性仍表征不足。本研究评估了8株先前从健康阿尔及利亚女性分离并基于益生相关特性筛选的LAB菌株调节巨噬细胞免疫应答的能力。研究人员在基础条件下及脂多糖（LPS）刺激后，以猪肺泡巨噬细胞（PAM cells）对7株Lactiplantibacillus plantarum（N1、N2、N7、N11、N17、87JG8和87BG2）和1株Limosilactobacillus fermentum（70BJ2）进行初步筛选。观察到明显的菌株依赖性细胞因子谱。层次聚类将菌株分为两大组：N1、N2、N7和N11主要以较强的炎症反应为特征，而N17、87BG2、87JG8和70BJ2在较晚时间点表现出相对较低的炎症反应并伴随IL-6和IL-27表达增强。基于这些谱，选择N17、87JG8和70BJ2在猪肠道巨噬细胞（IPIM cells）和RAW 264.7小鼠巨噬细胞（RAW cells）中进一步表征。在IPIM细胞中，70BJ2降低LPS诱导的TNF-α和IL-6表达，而N17在LPS刺激后增强IL-10和IL-27表达。在RAW细胞中，N17和87JG8增强多种炎症和趋化因子反应，而三株均增加IFN-γ、IL-12、CSF3、IL-10和IL-27，其中70BJ2诱导最强的IL-10和IL-27反应并独特增加CSF2。总体而言，阴道LAB显示菌株和巨噬细胞依赖的免疫调节谱，而非一致抑制或增强LPS诱导的炎症。在所选菌株中，Lmb. fermentum 70BJ2在跨巨噬细胞模型中表现出尤其突出的调节特性。这些发现拓展了阴道LAB的功能表征，并支持其菌株水平评估以鉴定能够调节黏膜免疫应答的候选免疫生物制剂。

研究背景与问题：阴道微生物群通过抵御病原体和塑造局部免疫应答参与黏膜稳态。健康女性阴道微生态常以Lactobacillus属为主，其可通过代谢产物和菌体相关分子模式（MAMPs）与宿主免疫系统互作，影响上皮屏障完整性和病原体定植抵抗。然而，乳酸菌的免疫调节能力具有高度菌株依赖性，不同菌株可差异调节细胞因子产生、模式识别受体（PRRs）信号及包括巨噬细胞在内的免疫细胞功能。既往虽关注阴道乳酸菌功能特性，但单个阴道菌株如何影响巨噬细胞介导的先天免疫仍知之甚少；巨噬细胞是黏膜表面先天免疫的关键成分，参与病原识别、炎症反应和组织稳态协调。已有研究表明阴道乳酸菌可在体内调节局部免疫环境，Lactobacillus crispatus可在Chlamydia trachomatis感染中调节巨噬细胞反应，减少炎症介质并增强IL-10产生；Lactiplantibacillus plantarum干预在实验性外阴阴道念珠菌病中显示保护与免疫调节作用。LPS经Toll样受体4（TLR4）激活巨噬细胞是研究细菌刺激重塑炎症与调节反应的成熟实验系统，但巨噬细胞反应高度依赖细胞来源和激活背景，阴道LAB菌株是否在不同巨噬细胞模型中保留相似免疫调节特性尚不清楚。基于前期对健康阿尔及利亚女性阴道LAB抗菌、功能及益生相关特性的研究，研究人员选择8株菌进一步研究其免疫调节潜力，包括7株Lactiplantibacillus plantarum（N1、N2、N7、N11、N17、87JG8、87BG2）和1株Limosilactobacillus fermentum（70BJ2），旨在确定这些阴道分离株是否能差异调节巨噬细胞免疫应答，以及此类效应是否在不同细胞背景中保守。研究先在PAM cells中初筛，再用IPIM cells和RAW 264.7小鼠巨噬细胞（RAW cells）详细表征；同时评估基础条件和LPS刺激后反应，以分析对巨噬细胞活化及炎症/调节介质平衡的影响。研究结论表明阴道LAB呈现明显菌株依赖性免疫调节活性，并存在共享及巨噬细胞模型特异性反应模式；这些结果拓展了这些阴道分离株超越既往抗菌和益生相关特性的功能表征，鉴定出具有不同免疫生物制剂谱的菌株，为其作为靶向调节黏膜免疫应答的候选菌株进一步评价提供依据。

关键技术方法（不超过250字）：菌株来源为前期从健康阿尔及利亚女性阴道分离的8株LAB，系从259株阴道分离株中依据抗菌活性、乳酸和过氧化氢产生、生物膜形成、表面黏附及安全性等益生相关特性筛选；三株N17、87JG8和70BJ2供体的人口学、产科和阴道健康特征（含阴道pH和Nugent评分）见补充表S1。关键方法包括：采用PAM cells、IPIM cells和RAW cells三种巨噬细胞模型；以MOI=1预处理24 h后，PAM/IPIM以10 ng/mL、RAW以50 ng/mL LPS刺激；于0、3、6、12 h（部分动力学至9 h）用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测免疫介质mRNA，以β-肌动蛋白为内参，经标准曲线定量并相对对照归一化；采用层次聚类和热图分析，并以单因素/双因素方差分析（ANOVA）及Tukey多重比较进行统计。

研究结果：
3.1 在猪肺泡巨噬细胞中筛选免疫调节性阴道LAB菌株：在PAM cells基础条件下，Lpb. plantarum N1、N2和N7显著增加TNF-α表达；N11、N17、87JG8、87BG2及Lmb. fermentum 70BJ2未改变TNF-α；N1、N7、87JG8、87BG2及70BJ2显著降低IL-1β，而N2、N11、N17与对照相似；IL-6和IL-27未见变化。LPS刺激后，3 h时N1、N2、N7、N11和87BG2显著增强TNF-α，N17、87JG8和70BJ2显著降低TNF-α；6 h时N2、N7和N11降低TNF-α；12 h未见显著差异。IL-1β在3 h时被N2、N7、N11、N17、87BG2和70BJ2显著增强，N11效应最显著；6 h时N17和87JG8增强IL-1β，N11降低IL-1β；12 h无差异。IL-6在3 h无差异，N17、87BG2、87JG8和70BJ2在6和12 h显著增强IL-6。IL-27在3 h仅N11上调；6 h时N1、N2、N7和N11降低IL-27，而N17、87BG2、87JG8和70BJ2显著增强IL-27；N17、87BG2、87JG8和70BJ2的IL-27增强维持至12 h。层次聚类和热图将菌株分为两群：N1、N2、N7、N11以早期较强TNF-α和IL-1β及较低IL-27为特征；N17、87BG2、87JG8、70BJ2显示较低促炎介质及较晚时间点较高IL-6和IL-27。基于此，N17、87JG8和70BJ2因3 h显著降低TNF-α且后期增强IL-6和IL-27而被选进一步表征；87BG2虽在同一聚类，但3 h增加TNF-α，故未优先选择。
3.2 所选免疫调节LAB菌株在猪肠道巨噬细胞中的作用：研究人员先比较PAM cells与IPIM cells的LPS反应动力学，发现PAM cells中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-27呈短暂变化，IL-10低于检测限；IPIM cells呈较持续反应，TNF-α、IL-1β和IL-6明显增加，并诱导IL-10和IL-27，因而提供额外调节参数。基础条件下，IPIM cells中LAB处理与对照的TNF-α或IL-6无显著差异；IL-1β仅在Lpb. plantarum N17处理组显著降低；三株均增强IL-27，87JG8和70BJ2增强IL-10，且70BJ2对两种调节细胞因子的提升最显著。LPS刺激后，仅Lmb. fermentum 70BJ2在3和12 h显著降低TNF-α和IL-6；各株均未显著改变IL-1β；N17在3和12 h显著增强IL-10；6 h时87JG8显著降低IL-27，12 h时N17显著增强IL-27。结果说明所选菌株在IPIM cells中差异调节炎症和调节反应，且菌株特异性效应与PAM cells不同。
3.3 所选免疫调节LAB菌株在小鼠巨噬细胞中的作用：在RAW cells中，LPS刺激后12 h，N17和87JG8显著增强TNF-α、IL-1β和CCL8；三株均增强IL-6和CCL2，其中N17和87JG8为p < 0.01、70BJ2为p < 0.05；仅70BJ2降低CCL5。三株均增强IFN-γ、IL-12和CSF3，N17对CSF3为p < 0.01，87JG8和70BJ2为p < 0.05；仅70BJ2增加CSF2。三株均显著增加IL-10和IL-27，且70BJ2对二者效应最强。综合三个模型，阴道LAB呈现菌株和细胞依赖的免疫调节谱，并非统一抑制LPS诱导反应；N17和87JG8在RAW cells中偏免疫刺激，70BJ2在跨模型调节特征最突出。

讨论部分总结与研究结论翻译：讨论指出，阴道LAB并不统一抑制或增强巨噬细胞活化，单个菌株产生的免疫调节谱在方向和幅度上取决于巨噬细胞背景。PAM cells初筛显示明显功能异质性，聚类区分出较强早期炎症反应群与较弱炎症反应但后期较高IL-6和IL-27群，提示阴道LAB差异调节TLR4诱导反应的动力学；这与LAB菌株依赖性免疫调节及同一物种遗传不同菌株可诱导不同细胞因子反应的既往认识一致，说明不能由物种身份外推功能特性。IPIM cells补充了PAM cells结果，两个猪巨噬细胞模型LPS刺激后细胞因子动力学不同，提示细胞背景影响炎症反应；IPIM cells显示强炎症反应后IL-10和IL-27诱导，而PAM cells在评估条件下IL-10不可检测。IPIM cells中70BJ2在基础条件诱导IL-10和IL-27最突出，并在LPS刺激后减弱TNF-α和IL-6，提示其影响巨噬细胞活化的多个组分而非单纯普遍抑制；IL-27可促进IL-10介导的调节反应以限制过度炎症，且该结果与其他Lmb. fermentum菌株抗炎和免疫调节报道一致。N17在IPIM cells对炎症细胞因子作用有限但增强IL-10和IL-27，呈主要调节模式；87JG8作用更有限，说明PAM筛选出的三株在不同巨噬细胞背景下未保持完全相同免疫调节谱。RAW cells提供跨物种视角并扩展免疫介质 panel；N17和87JG8主要呈免疫刺激特征，增强TNF-α、IL-1β、IL-6、CCL2、CCL8、IFN-γ和IL-12，这种协调反应可能反映增强巨噬细胞活化而不一定代表普遍炎症；N17和87JG8增加CSF3，CSF3是粒细胞生成和中性粒细胞动员的重要调节因子，与炎症细胞因子和趋化因子共同诱导提示可能促进先天效应细胞募集和活化相关免疫程序。讨论强调不能将更强炎症活化解释为内在有益，有效巨噬细胞调节涉及炎症和调节通路的协调调控；N17和87JG8在RAW cells中的免疫刺激特征与既往免疫生物制剂特性一致，但需功能研究确定转录变化是否转化为增强抗菌活性或病原抵抗。70BJ2在RAW cells诱导最高IL-10和IL-27，强化其在IPIM cells中的调节表型，提示该调节特性在巨噬细胞模型间相对保守；IL-10和IL-27协同诱导参与限制过度炎症的反馈机制，同时70BJ2还增强CSF2，CSF2参与炎症条件下巨噬细胞存活、分化和功能能力，因此70BJ2不能简单描述为抗炎，而应视为更广泛的免疫调节效应。讨论还指出，同一LAB菌株的免疫调节表型不能脱离应答免疫细胞来考虑；N17和87JG8在PAM、IPIM和RAW cells中效应差异较大，而70BJ2跨细胞背景保留较可识别的调节谱。这种背景依赖性可能与细菌MAMPs（包括细胞壁成分和表面相关分子）差异及不同来源巨噬细胞识别和信号通路差异有关；TLR2和NOD2等参与革兰阳性菌识别的PRRs可能参与，但本研究未直接评估其表达和功能参与。互补巨噬细胞模型可提供单一细胞系统筛选遗漏的信息。另需注意，本研究所评估菌株基于既往益生相关特性而非阴道微生物群相对丰度选择；尽管Lpb. plantarum和Lmb. fermentum可从人阴道环境分离，但L. crispatus、L. iners、L. gasseri和L. jensenii更常与乳杆菌主导的阴道群落相关，因此这些菌株不应被视为健康阴道微生物群整体分类组成的代表；其阴道来源和既往功能特性支持作为具有潜在免疫调节活性的个体候选进行评价。研究结论（译）：本研究证明阴道LAB菌株诱导不同的、菌株特异性免疫介质转录谱，且该转录谱受巨噬细胞背景强烈影响。在所评估菌株中，Lmb. fermentum 70BJ2在巨噬细胞模型间显示最一致的调节谱，保持增强调节介质并调节炎症反应的特征倾向。相比之下，Lpb. plantarum N17和87JG8显示更可变的谱，根据细胞模型和刺激条件在调节性和免疫刺激性反应之间转换。这些发现强调，免疫调节特性不能仅从细菌物种或单一细胞系统中的观察推断，并突出在互补免疫模型中进行菌株水平表征的重要性。70BJ2反应的相对一致性鉴定该菌株为进一步研究特别有前景的候选。未来需使用阴道免疫细胞模型、相关病原体攻击和体内方法，确定这些免疫调节特性是否在阴道黏膜环境中重现，并转化为改善宿主防御和控制过度炎症。